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Examen critique de deux hybrides : Avantages et désavantages

l'examen critique de Deux-hybride a été développé au cours de la dernière décennie pour activer l'identification de la protéine-protéine et des interactions ADN-protéines avec la caractérisation de leurs interactions et de leur manipulation.

Crédit : Thanakrit Sathavornmanee/Shutterstock.com

L'interaction entre les protéines joue un rôle indispensable dans des plusieurs mécanismes biologiques. Le système de deux-hybride de levure est employé pour recenser un grand nombre d'interactions de protéines in vivo. Les propriétés normales des facteurs eucaryotiques de transcription tels que GAL4 ont introduit cette technique.

Les activateurs de transcription possèdent au moins deux domaines fonctionnels discrets dirigeant les facteurs de transcription pour gripper avec une séquence d'ADN de promoteur et activant le procédé de transcription.

Le système de deux-hybride exploite le fait que le domaine ADN-grippant de GAL4 active la transcription seulement par interaction matérielle, mais n'est pas essentiel de s'associer à un domaine de commande.

Avantages du système de deux-hybride

Le système de deux-hybride est dû populaire à sa souplesse et isolement rapide des protéines de interaction.

Pendant que la technique est employée pour recenser des interactions de protéines dans une cellule de levure vivante, elle offre un certain nombre d'avantages, y compris la purification de protéine et le développement d'anticorps à bas pris, ainsi que moins de méthode longue de trouver des protéines de interaction de roman, avec des méthodes biochimiques et génétiques conventionnelles.

C'est in vivo une technique concernant la levure comme éprouvette d'hôte. Les cellules de levure représentent une forme eucaryotique plus élevée, qui montrent les approches plus proches de réalité qu'in vitro ou les techniques bactériennes d'expression.

Comparé aux approches biochimiques classiques, où de grandes quantités de protéines ou d'anticorps fortement épurés sont exigées, seulement un ADNc ou un gène spécifique d'intérêt est nécessaire dans le système de deux-hybride.

Le système de deux-hybride est également employé pour analyser des interactions connues en recensant les résidus critiques pour l'interaction ou par la caractérisation fonctionnelle du sous-domaine complet. À partir de cette technique, des affinités des interactions de protéines sont également déterminées en exécutant l'analyse semi-quantitative.

Les caractéristiques les plus significatives du système de deux-hybride sont la technique à deux dents de recenser une protéine de interaction et clonage du gène.

La technique est également représentée en tant qu'écrans fonctionnels parce que cela aide en recensant le fonctionnement de la protéine en agissant l'un sur l'autre avec le fonctionnement déjà connu de protéine.

Inconvénients du système de deux-hybride

Quoique le système de deux-hybride ait beaucoup d'approches positives en biologie moléculaire, il ne peut pas fournir une solution pour toutes les éditions de protéine-protéine.

Depuis 1989, l'approche de deux-hybride a évolué avec des nouveautés pour augmenter ses possibilités d'application.

Un des inconvénients les plus significatifs de cette technique détermine si la protéine spécifique d'intérêt peut commencer la transcription. L'approche peut être couronnée de succès seulement quand la protéine active la transcription seule.

L'autre préoccupation de la technique est l'utilisation large des chimères.

Les protéines synthétiques de fusion posent toujours un risque possible de modifier l'agencement symétrique réel de l'amorce ou de la proie et, en conséquence, de modifier ses fonctionnalités. Ceci pourrait également avoir en activité limitée ou comme conséquence l'inaccessibilité aux accepteurs.

Un des désavantages principaux est l'utilisation des saccharomyces cerevisiae en tant que cellule hôte ; la protéine d'intérêt doit pouvoir se plier correctement avec la stabilité dans la cellule de levure.

Un autre du côté incliné est que quelques interactions de protéines dépendent des modifications goujon-de translation qui peuvent se produire ou ne pas se produire inapproprié en levure.

Les modifications comprennent la glycosylation, la formation des liaisons disulfide, et la phosphorylation. Cependant, quelques systèmes neufs de deux-hybride essayent de surmonter cette difficulté Co-en exprimant les enzymes qui entraînent des modifications de posttranslational.

Il y a une possibilité pour le désavantage dans le cas d'une protéine ou d'une protéine extracellulaire qui se compose des signes de désignation d'objectifs puissants quand les protéines de fusion visent le noyau de levure dans le système de deux-hybride. Une bonne description des bibliothèques d'ADNc est exigée pour l'examiner.

En levure, quelques protéines peuvent devenir toxiques lorsque la protéine de codage de gène est exprimée.

Il y a plusieurs protéines telles que des cyclines ou des produits de gène homéotique qui sont toxiques au noyau de cellules de levure. Ce problème peut être évité à l'aide d'un promoteur inductible. Ceci évite les protéines essentielles de levure impliquées dans le domaine obligatoire d'ADN ou le domaine d'activation obtenant proteolyzed par l'autre transfecté de protéines dans la levure.

Des faux positifs et les faux négatifs s'avèrent élevés dans des systèmes de deux-hybride.

La négativité trompeuse pourrait se produire quand l'obstacle stérique est provoqué par les protéines protégées par fusible de journaliste de la levure.

Une raison complémentaire d'entraîner des faux négatifs est des modifications différentes ou absentes de posttranslational des protéines dans le système de levure en vérifiant des interactions de protéines parmi des eucaryotes plus élevés.

Pendant cette situation, les enzymes de modification pourrait Co-exprès, avec la proie et l'amorce. Ce coexpression est couronné de succès en recensant des interactions tyrosine-phosphorylation-dépendantes. Même les interactions de courte durée temporaires ne pourraient pas être trouvées par cette technique.

Supplémentaire, l'absence des modifications complexes de protéine telles que la glycosylation complexe dans la cellule hôte de levure apparaît pour être plus provocante pour surmonter.

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Last Updated: Feb 26, 2019

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