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Una selezione di due ibridi: Vantaggi e svantaggi

la selezione dell'Due-ibrido è stata sviluppata negli ultimi dieci anni per permettere all'identificazione di proteina-proteina e di interazioni proteina-DNA con la caratterizzazione delle loro interazioni e della loro manipolazione.

Credito: Thanakrit Sathavornmanee/Shutterstock.com

L'interazione fra le proteine svolge un ruolo vitale in parecchi meccanismi biologici. Il sistema dell'due-ibrido del lievito è usato per identificare tantissime interazioni della proteina in vivo. I beni standard dei fattori di trascrizione eucariotici quale GAL4 hanno promosso questa tecnica.

Gli attivatori della trascrizione possiedono almeno due domini funzionali discreti che dirigono i fattori di trascrizione per legare con una sequenza del DNA del promotore e che attivano il trattamento della trascrizione.

Il sistema dell'due-ibrido sfrutta il fatto che il dominio dell'DNA-associazione di GAL4 attiva la trascrizione soltanto da interazione fisica, ma non è cruciale da associarsi con un dominio d'attivazione.

Vantaggi del sistema dell'due-ibrido

Il sistema dell'due-ibrido è popolare dovuto la sui flessibilità ed isolamento della rapida delle proteine d'interazione.

Mentre la tecnica è usata per identificare le interazioni della proteina in una cella di lievito vivente, offre una serie di vantaggi, compreso depurazione della proteina e lo sviluppo dell'anticorpo a basso costo come pure un metodo meno che richiede tempo di rilevazione delle proteine d'interazione del romanzo, rispetto ai metodi biochimici e genetici convenzionali.

È in vivo una tecnica che comprende il lievito poichè una provetta ospite. Le celle di lievito rappresentano un più alto modulo eucariotico, che esibiscono gli approcci più vicini della realtà in vitro o le tecniche batteriche di espressione.

Confrontato agli approcci biochimici classici, dove un gran quantità di proteine o di anticorpi altamente depurativi sono richiesti, solo un cDNA o un gene specifico di interesse è necessario nel sistema dell'due-ibrido.

Il sistema dell'due-ibrido egualmente è usato per analizzare le interazioni conosciute identificando i residui critici per interazione o dalla caratterizzazione funzionale del sottodominio completo. Da questa tecnica, le affinità delle interazioni della proteina egualmente sono determinate eseguendo l'analisi semiquantitativa.

Le funzionalità più significative del sistema dell'due-ibrido sono la tecnica a due punte di identificazione della proteina d'interazione e clonazione del gene.

La tecnica egualmente è rappresentata come schermi funzionali perché quel aiuta nell'identificazione della funzione della proteina quando interagiscono con la funzione già conosciuta della proteina.

Svantaggi del sistema dell'due-ibrido

Anche se il sistema dell'due-ibrido ha molti approcci positivi nella biologia molecolare, non può fornire una soluzione per tutte emissioni della proteina-proteina.

Dal 1989, l'approccio dell'due-ibrido si è evoluto con le novità per aumentare la sua applicabilità.

Uno degli svantaggi più significativi di questa tecnica sta determinando se la proteina specifica di interesse può iniziare la trascrizione. L'approccio può riuscire soltanto quando la proteina attiva la trascrizione da sè.

L'altra preoccupazione della tecnica è l'ampio uso delle chimere.

Le proteine sintetiche di fusione comportano sempre un rischio possibile di alterazione della disposizione simmetrica reale dell'esca o della preda e, pertanto, di modificazione delle sue funzionalità. Ciò ha potuto anche provocare nell'attività limitata o l'inaccessibilità alle sedi del legame.

Uno degli svantaggi principali è l'uso del saccharomyces cerevisiae come la cellula ospite; la proteina di interesse deve potere profilatura correttamente con la stabilità all'interno della cella di lievito.

Un altro lato negativo è che alcune interazioni della proteina dipendono dalle modifiche post-di traduzione che non possono accadere o accadere inadatto in lievito.

Le modifiche comprendono la glicosilazione, la formazione di legami bisolfurico e la fosforilazione. Tuttavia, alcuni nuovi sistemi dell'due-ibrido stanno provando a superare questa difficoltà co-esprimendo gli enzimi che causano i cambiamenti di posttranslational.

C'è una possibilità per lo svantaggio nel caso di una proteina o di una proteina extracellulare che consiste dei segnali d'ottimizzazione potenti quando le proteine di fusione mirano al nucleo del lievito nel sistema dell'due-ibrido. Un buon dipinto delle librerie del cDNA è richiesto per schermarlo.

In lievito, alcune proteine possono diventare tossiche quando la proteina della codifica del gene è espressa.

Ci sono parecchie proteine quali i cyclins o i prodotti del gene di homeobox che sono tossici al nucleo delle cellule di lievito. Questo problema può essere evitato usando un promotore viscoelastico. Ciò impedisce le proteine cruciali del lievito in questione nel dominio obbligatorio del DNA o nel dominio di attivazione che ottiene proteolyzed da altre proteine transfected nel lievito.

I falsi positivi ed i falsi negativi sono trovati per essere alti nei sistemi dell'due-ibrido.

La negatività falsa potrebbe accadere quando l'ostacolo sterico è causato dalle proteine fuse del reporter di lievito.

Una ragione supplementare per causare i falsi negativi è modifiche dissimili o assenti di posttranslational delle proteine nel sistema del lievito quando studia le interazioni della proteina fra gli più alti eucarioti.

Durante questa situazione, gli enzimi di modificazione potrebbe co-preciso, con la preda e l'esca. Questo coexpression riesce nell'identificazione delle interazioni tirosina-fosforilazione-dipendenti. Neppure le interazioni di breve durata temporanee non hanno potuto essere individuate da questa tecnica.

Ulteriormente, l'assenza di modifiche complesse della proteina quale la glicosilazione complessa nella cellula ospite del lievito emerge per essere più provocatoria sormontare.

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Last Updated: Feb 26, 2019

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