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Selecção de dois híbrido: Vantagens e desvantagens

a selecção do Dois-híbrido foi desenvolvida ao longo da última década para permitir a identificação da proteína-proteína e das interacções proteína-ADN junto com a caracterização de suas interacções e de sua manipulação.

Crédito: Thanakrit Sathavornmanee/Shutterstock.com

A interacção entre proteínas joga um papel vital em diversos mecanismos biológicos. O sistema do dois-híbrido do fermento é usado para identificar in vivo um grande número interacções da proteína. As propriedades padrão de factores eucarióticas da transcrição tais como GAL4 promoveram esta técnica.

Os activadores da transcrição possuem pelo menos dois domínios funcionais discretos que dirigem os factores da transcrição para ligar com uma seqüência do ADN do promotor e que ativam o processo da transcrição.

O sistema do dois-híbrido explora o facto de que o domínio ADN-obrigatório de GAL4 activa a transcrição somente pela interacção física, mas não é crucial de associar com um domínio de activação.

Vantagens do sistema do dois-híbrido

O sistema do dois-híbrido é popular devido a seus flexibilidade e isolamento rápido de proteínas de interacção.

Enquanto a técnica é usada para identificar interacções da proteína em uma pilha de fermento viva, oferece um número de vantagens, incluindo a purificação da proteína e a revelação do anticorpo a um baixo custo, assim como um método menos demorado da detecção de proteínas de interacção da novela, comparada com os métodos bioquímicos e genéticos convencionais.

É in vivo uma técnica que envolve o fermento como um tubo de ensaio do anfitrião. As pilhas de fermento representam um formulário eucariótica mais alto, que exibem as aproximações mais próximas da realidade do que in vitro ou as técnicas bacterianas da expressão.

Comparado às aproximações bioquímicas clássicas, onde as grandes quantidades de proteínas ou de anticorpos altamente refinados são exigidas, simplesmente um cDNA ou um gene específico do interesse são necessário no sistema do dois-híbrido.

O sistema do dois-híbrido é usado igualmente para analisar interacções conhecidas identificando resíduos críticos para a interacção ou pela caracterização funcional do subdomínio completo. Desta técnica, as afinidaoes das interacções da proteína são determinadas igualmente executando a análise semiquantitativa.

As características as mais significativas do sistema do dois-híbrido são a técnica de duas pontas de identificar uma proteína de interacção e clonar do gene.

A técnica é representada igualmente como telas funcionais porque esse ajuda em identificar a função da proteína ao interagir com a função já conhecida da proteína.

Inconvenientes do sistema do dois-híbrido

Mesmo que o sistema do dois-híbrido tenha muitas aproximações positivas na biologia molecular, não pode fornecer uma solução para todas as edições da proteína-proteína.

Desde 1989, a aproximação do dois-híbrido evoluiu com novidades para aumentar sua aplicabilidade.

Um dos inconvenientes os mais significativos desta técnica está determinando se a proteína específica do interesse pode iniciar a transcrição. A aproximação pode ser bem sucedida somente quando a proteína activa a transcrição no seus próprios.

O outro interesse da técnica é o uso largo das quimeras.

As proteínas sintéticas da fusão levantam sempre um risco possível de alterar o regime simétrico real da isca ou da rapina e, conseqüentemente, de alterar suas funcionalidades. Isto pôde igualmente conduzir em actividade limitada ou à inacessibilidade aos locais obrigatórios.

Uma das desvantagens principais é o uso de Saccharomyces Cerevisiae como a pilha de anfitrião; a proteína do interesse deve poder dobrar-se correctamente com estabilidade dentro da pilha de fermento.

Um outro downside é que algumas interacções da proteína dependem das alterações cargo-translational que não podem ocorrer ou ocorrer inoportuna no fermento.

As alterações incluem o glycosylation, a formação de ligações de bissulfeto, e a fosforilação. Contudo, alguns sistemas novos do dois-híbrido estão tentando superar esta dificuldade co-expressando as enzimas que causam mudanças do posttranslational.

Há uma possibilidade para a desvantagem no caso de uma proteína ou da proteína extracelular que consiste em sinais de escolha de objectivos poderosos quando as proteínas da fusão visam o núcleo do fermento no sistema do dois-híbrido. Uma boa descrição de bibliotecas do cDNA é exigida para selecioná-lo.

No fermento, algumas proteínas podem tornar-se tóxicas então a proteína da codificação do gene é expressada.

Há diversas proteínas tais como cyclins ou produtos do gene do homeobox que são tóxicos ao núcleo de pilha do fermento. Este problema pode ser evitado usando um promotor inducible. Isto impede as proteínas cruciais do fermento envolvidas em domínio obrigatório do ADN ou em domínio da activação que obtêm proteolyzed por outras proteínas transfected no fermento.

Os falsos positivos e os negativos falsos são encontrados para ser altos em sistemas do dois-híbrido.

A negatividade falsa pôde ocorrer quando o obstáculo steric é causado por proteínas fundidas do repórter do fermento.

Uma razão adicional para causar negativos falsos é alterações dissimilares ou ausentes do posttranslational das proteínas no sistema do fermento ao investigar interacções da proteína entre uns eukaryotes mais altos.

Durante esta situação, as enzimas de alteração pôde co-expresso, junto com a rapina e a isca. Este coexpression é bem sucedido em identificar interacções tirosina-fosforilação-dependentes. Mesmo as breves interacções provisórias não puderam ser detectadas por esta técnica.

Adicionalmente, a ausência de alterações complexas da proteína tais como o glycosylation complexo na pilha de anfitrião do fermento emerge para ser mais desafiante superar.

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Last Updated: Feb 26, 2019

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