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Investigación de dos híbridos: Ventajas y desventajas

la investigación del Dos-híbrido se ha desarrollado durante la última década para habilitar la identificación de la proteína-proteína y de las acciones recíprocas proteína-DNA junto con la caracterización de sus acciones recíprocas y de su manipulación.

Haber: Thanakrit Sathavornmanee/Shutterstock.com

La acción recíproca entre las proteínas desempeña un papel vital en varios mecanismos biológicos. El sistema del dos-híbrido de la levadura se utiliza para determinar un gran número de acciones recíprocas de la proteína in vivo. Las propiedades estándar de los factores eucarióticos de la transcripción tales como GAL4 han ascendido esta técnica.

Los activadores de la transcripción poseen por lo menos dos dominios funcionales discretos que ordenan los factores de la transcripción para atar con una serie de la DNA del promotor y que activan el proceso de la transcripción.

El sistema del dos-híbrido explota el hecho de que el dominio DNA-obligatorio de GAL4 activa la transcripción solamente por la acción recíproca física, pero no es crucial de asociarse a un dominio que activa.

Ventajas del sistema del dos-híbrido

El sistema del dos-híbrido es popular debido a su adaptabilidad y aislamiento rápido de proteínas que obran recíprocamente.

Mientras que la técnica se utiliza para determinar acciones recíprocas de la proteína en una célula de levadura viva, ofrece varias ventajas, incluyendo la purificación de la proteína y el revelado del anticuerpo a bajo costo, así como un método menos que toma tiempo de descubrir de las proteínas que obran recíprocamente de la novela, comparado con métodos bioquímicos y genéticos convencionales.

Es in vivo una técnica que implica la levadura como tubo de ensayo del ordenador principal. Las células de levadura representan una forma eucariótica más alta, que exhiben las aproximaciones más cercanas de la realidad que in vitro o las técnicas bacterianas de la expresión.

Comparado a las aproximaciones bioquímicas clásicas, donde se requieren una gran cantidad de proteínas o de anticuerpos altamente purificados, sólo un cDNA o un gen específico del interés se necesita en sistema del dos-híbrido.

El sistema del dos-híbrido también es utilizado para analizar acciones recíprocas sabidas determinando los residuos críticos para la acción recíproca o por la caracterización funcional del subdomain completo. De esta técnica, las afinidades de las acciones recíprocas de la proteína también son determinadas realizando análisis semiquantitativo.

Las características más importantes del sistema del dos-híbrido son la técnica doble de determinar una proteína que obra recíprocamente y clonación del gen.

La técnica también se representa como pantallas funcionales porque ese ayuda en determinar la función de la proteína al obrar recíprocamente con la función ya sabida de la proteína.

Desventajas del sistema del dos-híbrido

Aunque el sistema del dos-híbrido tiene muchas aproximaciones positivas en biología molecular, no puede ofrecer una solución para todas las entregas de la proteína-proteína.

Desde 1989, la aproximación del dos-híbrido se ha desarrollado con novedades para aumentar su aplicabilidad.

Una de las desventajas más importantes de esta técnica está determinando si la proteína específica del interés puede iniciar la transcripción. La aproximación puede ser acertada solamente cuando la proteína activa la transcripción en sus los propio.

La otra preocupación de la técnica es el uso amplio de quimeras.

Las proteínas sintetizadas de la fusión plantean siempre un riesgo posible de alterar la ordenación simétrica real del cebo o de la presa y, por lo tanto, de modificar sus funciones. Esto pudo también dar lugar en actividad limitada o a la inaccesibilidad a los puntos de enlace.

Una de las desventajas mayores es el uso de Saccharomyces Cerevisiae como la célula huesped; la proteína del interés debe poder doblar correctamente con estabilidad dentro de la célula de levadura.

Otra desventaja es que algunas acciones recíprocas de la proteína dependen de las modificaciones poste-de translación que pueden ocurrir o no ocurrir inadecuado en levadura.

Las modificaciones incluyen el glycosylation, la formación de ligazones de disulfuro, y la fosforilación. Sin embargo, algunos nuevos sistemas del dos-híbrido están intentando superar esta dificultad co-expresando las enzimas que causan cambios del posttranslational.

Hay una posibilidad de la desventaja en el caso de una proteína o de la proteína extracelular que consiste en señales de alcance potentes cuando las proteínas de la fusión apuntan el núcleo de la levadura en el sistema del dos-híbrido. Una buena pintura de las bibliotecas del cDNA se requiere para revisarlo.

En levadura, algunas proteínas pueden llegar a ser tóxicas cuando se expresa la proteína de la codificación del gen.

Hay varias proteínas tales como cyclins o productos del gen de la caja homeo que sean tóxicos al núcleo de célula de levadura. Este problema se puede evitar usando un promotor inducible. Esto previene las proteínas cruciales de la levadura implicadas en el dominio obligatorio de la DNA o el dominio de la activación que consigue proteolyzed por otras proteínas transfected en la levadura.

Los positivos falsos y los falsos negativos se encuentran para ser altos en sistemas del dos-híbrido.

La negatividad falsa pudo ocurrir cuando el obstáculo estérico es causado por las proteínas fundidas del reportero de la levadura.

Una razón adicional de causar falsos negativos es modificaciones disímiles o ausentes del posttranslational de proteínas en el sistema de la levadura al investigar acciones recíprocas de la proteína entre eucariotas más altos.

Durante esta situación, las enzimas de modificación pudo co-expreso, junto con la presa y el cebo. Este coexpression es acertado en determinar acciones recíprocas tirosina-fosforilación-relacionadas. Incluso las acciones recíprocas efímeras temporales no se pudieron descubrir por esta técnica.

Además, la ausencia de modificaciones complejas de la proteína tales como glycosylation complejo en la célula huesped de la levadura emerge para ser más desafiadora vencer.

Fuentes:

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Last Updated: Feb 26, 2019

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