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Fluorochromes compreensivos para o uso no Cytometry de fluxo

O cytometry de fluxo é um método popular do laboratório de biologia celular. Usa um laser para a análise, a quantificação, e a classificação rápidas de uma suspensão de pilhas vivas. Em uma matéria dos nanossegundos, os perfis das propriedades da população da pilha são adquiridos, incluindo o tamanho e a granulação. Isto é baseado no teste padrão característico da luz refratado das pilhas. É então possível refinar a população da pilha classificando os nos canais distintos segundo suas propriedades distintas.

Os Fluorochromes são usados para um número de aplicações. Aqui, os marcadores da pilha foram destacados com um marcador fluorescente (um fluorochrome).Carl Du Pont | Shutterstock

Quando uma investigação mais detalhada de uma população da pilha é exigida, os anticorpos etiquetados com as tinturas fluorescentes estão usados para identificar a presença ou a ausência de marcadores celulares particulares. Detectar proteínas específicas (tais como marcadores do CD) em uma população da pilha pode ajudar a determinar tipos da pilha, e esta é sabida como immunophenotyping.

Que são fluorochromes?

Os marcadores fluorescentes são sabidos como fluorochromes, um termo que seja usado permutavelmente com fluoróforo. Em cima da absorção da luz de um laser, transformam-se ` entusiasmado' e emitem-se a luz em um comprimento de onda mais longo para retornar a seu ` original' estado de energia mmoído, que é sabido como a fluorescência.

Cada fluorochrome absorve e emite-se a luz em uma escala específica dos comprimentos de onda. O comprimento de onda emissor, mais longo da luz é idealmente uma cor diferente ao laser para a detecção fácil de fluorescência. Por exemplo, o fluorochrome o mais amplamente utilizado, isothiocyanate de fluoresceína (FITC), tem uma absorvência máxima de 494nm e uma emissão máxima de 512nm que corresponde às cores azuis e verdes.

Os fluorochromes emocionantes em sua absorvência máxima (um pouco do que no fim inferior de seu espectro da absorvência), permitem uma emissão clara mais intensa. Embora os fluorochromes tenham espectros específicos do comprimento de onda, estão sobrepor frequentemente. Conseqüentemente, ao usar fluorochromes múltiplos, é importante escolher aqueles que não-estão sobrepor. Isto permite a diferenciação das características que da pilha estão destacando.

Aviva a SHIFT

Um outro aspecto importante para considerar quando escolher um fluorochrome é aviva a SHIFT: a diferença entre o comprimento de onda do fotão emocionante (o laser) e do fotão da emissão (da pilha de brilho). Um grande aviva a SHIFT é desejável de distinguir entre as cores diferentes dos fotão de excitação e emitindo-se.

Tinturas em tandem

As tinturas em tandem são feitas covalently ligando dois fluorochromes diferentes. Um assenta bem no doador e no outro um autómato. O doador é ` entusiasmado' e emite-se a luz que é absorvida pelo autómato, devido a transferência de energia da ressonância da fluorescência (FRET). Para que isto ocorra, os dois fluorochromes exigem a emissão de sobreposição/espectros de absorção.

Uma vantagem deste método é que uns aumentos mais ulteriores aviva a SHIFT para umas cores mais distinguíveis. Permite o uso de diversos fluorochromes em um painel, produzindo muitas cores para analisar parâmetros múltiplos. Uma limitação de tinturas em tandem é que são altamente sensíveis e degradam facilmente, especialmente quando expor à luz, tendo por resultado a fluorescência reduzida. É igualmente necessário monitorar o ambiente do pH de todos os fluorochromes, porque os níveis de deferimento do pH mudam seu brilho.

Pontos do quantum

Os nanocrystals pequenos (2-20 nanômetro), conhecidos como o quantum pontilham, são uma alternativa aos fluorochromes. O comprimento de onda emissor depende do tamanho do ponto do quantum. Têm uns espectros de emissão muito mais estreitos comparados aos fluorochromes padrão, reduzindo a possibilidade de cores de sobreposição quando o múltiplo deve ser usado.

Fontes

Further Reading

Last Updated: Jul 12, 2019

Stephanie Hunter

Written by

Stephanie Hunter

Stephanie obtained a first-class honors degree in Biomedical Science from the University of Sheffield in 2017. The modules she studied included: cell biology, membrane receptors, stem cells, tissue engineering, cancer, physiology, anatomy, and pharmacology. During her final year, she wrote a literature review on ‘Cell Therapy in Curing Muscular Dystrophy’, in which she analyzed different cell types with different genetic manipulations for their potential use in cell therapy.

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