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Utilisations des systèmes de CRISPR/Cas Biosensing

Le système de CRISPR/Cas 9 est généralement appliqué pour éditer des gènes dans les systèmes mammifères. Cependant, récent, l'enzyme Cas9 a expliqué le potentiel comme biocapteur, et des effecteurs variés de Cas maintenant sont appliqués à la diagnose moléculaire.

Saut à :

Système CRISPR-Cas9ibreakstock | Shutterstock

Types de systèmes CRISPR/Cas9 biosensing

Cas9 est l'une des enzymes principales du système CRISPR-Cas9 où il agit en tant que ciseaux moléculaires en coupant les deux brins d'ADN aux remarques spécifiques dans le génome. Ceci est accompli avec l'aide de l'ARN d'un guide qui grippe à l'ADN et aux « guides » Cas9 à la région correcte. Ce système est actuel employé pour produire un système biosensing.

Plus particulièrement, le Cas9 nucléase-neutralisé (dCas9) maintient toujours sa capacité de gripper à l'objectif ADN bicaténaire. Par conséquent, cette enzyme peut être ajoutée aux journalistes variés, tels que la protéine fluorescente de fractionnement ou l'enzyme de fractionnement pour produire un module biosensing.  Quand dCas9 grippe à l'acide nucléique d'objectif, il entraîne la réintégration de la protéine ou de l'enzyme fluorescente de fractionnement, aboutissant à la fluorescence cette des aides dans le dépistage de signe.

Actuel, il y a trois types de systèmes biosensing effecteur-dépendants de Cas qui promettent des découvertes considérables dans la diagnose de CRISPR : système dCas9 basé sur effecteur, système de dCas12-effector-based, et système dCas13 basé sur effecteur.

dCas9

La combinaison de Cas9 et d'amplification d'acide nucléique peut être employée pour trouver des séquences spécifiques d'acide nucléique. Ceci peut par la suite être employé aux agents pathogènes de génotype ; par exemple, une séquence combinée par étude récente d'acide nucléique a basé l'amplification (NASBA) et l'effecteur Cas9 pour trouver et le virus de Zika de génotype.

Cette approche a pu augmenter la spécificité jusqu'à une base unique. En outre, l'ARN de guide n'a été conçu pour contenir un présent unique de polymorphisme (SNP) de nucléotide seulement dans le génome de l'Américain, mais pas de l'Africain Zika. Par conséquent, cette méthode a pu correctement discerner des génotypes variés de virus de Zika.

Cas13

Le Cas13 est un RNAase qui appartient au système du type IV CRISPR/Cas. Il contient les domaines nucléotide-grippants de l'eucaryote deux et du prokaryote (HEPN). Cas 13 a également des fonctionnements non-canoniques où l'enzyme transforme en endonucléase avec de l'ARN de monocaténaire dégradant des propriétés. Cette propriété de Cas13 se nomme en tant qu'activité collatérale de clivage.

Le premier biocapteur basé par CRISPR/Cas13 a été développé par Gootenberg et collègues. Cette méthode est SHERLOCK appelé (ou journaliste enzymatique de sensibilité élevée spécifique débloquant) et a le potentiel de trouver des objectifs d'ADN et d'ARN à une définition d'unique-base.

Ce système a été employé pour trouver la dengue et le virus de Zika, les isolats bactériens, les gènes résistant aux antibiotiques, les mutations de cancer, et les génotypes humains d'ADN. Cas13a et Cas13b se sont avérés pour présenter les propriétés collatérales de clivage d'ARN.

Cas12

Indépendamment de Cas13, Cas 12a a également l'activité collatérale de clivage. Cependant, contrairement aux effecteurs Cas13, les effecteurs Cas12 fendent l'ADN monocatenaire dans la trans. Le premier cas du clivage de transport du clivage monocatenaire d'ADN et de son utilisation de trouver les acides nucléiques a été montré dans Chine en 2017. Cette méthode s'est nommée comme HOLMES (système très efficace polyvalent de coût bas d'une heure de r).

Au cours de cette période, un autre organisme de recherche en Amérique a montré qu'une méthode assimilée de Cas12-based détectait l'acide nucléique ce qui s'est nommé comme DETECTR (ou journaliste de transport de CRISPR endonucléase-visé par ADN). À l'aide de cette méthode, des virus variés de DNA/RNA, les génotypes viraux, et les polymorphismes uniques humains de nucléotide peuvent être trouvés dans un délai d'une heure des lignées cellulaires ou des échantillons cliniques avec la sensibilité élevée.

DETECTR peut également trouver et distinguer des génotypes variés des papillomavirus humains (HPV) dans les lignées cellulaires humaines infectées avec le virus ou même dans les échantillons patients cliniques. Cas 12 et les méthodes Cas13 exigent de l'amplification des acides nucléiques d'objectif d'augmenter la sensibilité de détection à la concentration d'AM. Ces méthodes peuvent également être employées en combination avec d'autres méthodes d'amplification d'acide nucléique.

Avantages des systèmes biosensing de CRISPR/Cas

Les systèmes biosensing mentionnés ci-dessus sont simples pour se développer ou reconstruire, ils ont très un de haute résolution qui peut trouver des variations jusqu'au niveau d'une base unique. En outre, il n'y a aucune condition des instruments complémentaires.

Ils peuvent être employés pour les systèmes diagnostiques de remarque-de-soins et peuvent également être personnalisés pour adapter à des medias in vitro variés. Car cette approche est tolérante des échantillons non traités variés et a très un coût bas, elle peut être employée pour des tâches d'examen critique de large échelle dans les cas où les moyens sont limités.

Limitations des systèmes biosensing de CRISPR/Cas

Tandis que les effecteurs de CRISPR, y compris Cas9 et Cas12, peuvent identifier et fendre n'importe quelle localisation d'objectifs, ils rendent nécessaire des séquences adjacentes de motif (PAM) de protospacer à côté de l'objectif ADN bicaténaire. En outre, la longueur de séquence de guide et la position du site de la mutation dans la séquence de guide peuvent influencer le rapport signal/bruit dans la méthode biosensing.

Actuel, seulement la méthode de SHERLOCK peut être employée pour trouver des séquences multiples, et ceci aussi est actuel limité à quatre objectifs. La plupart des méthodes biosensing de CRISPR exigent des échantillons d'être traités préalablement pour faciliter l'opération d'amplification et de dépistage.

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Last Updated: Jul 4, 2019

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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