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Usos de sistemas de CRISPR/Cas Biosensing

O sistema de CRISPR/Cas 9 está sendo empregado extensamente editando genes em sistemas mamíferos. Contudo, recentemente, a enzima Cas9 demonstrou o potencial como um biosensor, e os vários effectors do Cas estão sendo aplicados agora aos diagnósticos moleculars.

Faixa clara a:

Sistema CRISPR-Cas9ibreakstock | Shutterstock

Tipos dos sistemas CRISPR/Cas9 biosensing

Cas9 é uma das enzimas chaves do sistema CRISPR-Cas9 onde actua como um molecular scissor cortando as duas costas do ADN em pontos específicos no genoma. Isto é executado com a ajuda de um RNA do guia que ligue ao ADN e aos “guias” Cas9 à região correcta. Este sistema está sendo usado actualmente para criar um sistema biosensing.

Mais especificamente, o Cas9 nuclease-desativado (dCas9) ainda retem sua capacidade para ligar ao ADN dobro-encalhado alvo. Conseqüentemente, esta enzima pode ser acoplada com vários repórteres, tais como a proteína da separação ou a enzima fluorescente da separação para criar um módulo biosensing.  Quando dCas9 liga ao ácido nucleico do alvo, causa a reintegração da proteína ou da enzima fluorescente da separação, conduzindo à fluorescência essa auxílios na detecção de sinal.

Actualmente, há três tipos de sistemas biosensing effector-dependentes do Cas que prometem descobertas substanciais em diagnósticos de CRISPR: dCas9 effector-baseou o sistema, o sistema de dCas12-effector-based, e o sistema effector-baseado dCas13.

dCas9

A combinação de Cas9 e de amplificação do ácido nucleico pode ser usada para detectar seqüências específicas do ácido nucleico. Isto pode subseqüentemente ser usado aos micróbios patogénicos do genótipo; por exemplo, um estudo recente combinou a amplificação do ácido nucleico e o effector (NASBA) Cas9 para detectar e o vírus baseados seqüência de Zika do genótipo.

Esta aproximação podia aumentar a especificidade até uma única base. Também, o RNA do guia foi projectado conter um único presente do polimorfismo (SNP) do nucleotide somente no genoma do americano, mas não do africano Zika. Daqui, este método podia correctamente distinguir vários genótipo do vírus de Zika.

Cas13

O Cas13 é um RNAase que pertença ao tipo sistema de IV CRISPR/Cas. Contem os domínios nucleotide-obrigatórios do eukaryote dois e do prokaryote (HEPN). O Cas 13 igualmente tem as funções não-canônicas onde a enzima transforma no endonuclease com propriedades de degradação do RNA da única costa. Esta propriedade de Cas13 é denominada como a actividade colateral da segmentação.

O primeiro biosensor baseado CRISPR/Cas13 foi desenvolvido por Gootenberg e por colegas. Este método é chamado SHERLOCK (ou repórter enzimático da sensibilidade alta específica que destrava) e tem o potencial detectar alvos do ADN e do RNA em uma definição da único-base.

Este sistema foi usado para detectar a dengue e o vírus de Zika, isolados bacterianos, genes resistentes aos antibióticos, mutações do cancro, e genótipo humanos do ADN. Cas13a e Cas13b foram encontrados para exibir propriedades colaterais da segmentação do RNA.

Cas12

Independentemente de Cas13, o Cas 12a igualmente tem a actividade colateral da segmentação. Contudo, em contraste com os effectors Cas13, os effectors Cas12 fendem o ADN único-encalhado no transporte. O primeiro exemplo da segmentação do transporte da segmentação único-encalhada do ADN e do seu uso detectar ácidos nucleicos foi mostrado em China em 2017. Este método foi denominado como HOLMES (sistema altamente eficiente de múltiplos propósitos de uma hora do baixo custo de r).

Durante este período, um outro grupo de investigação em América mostrou um método similar de Cas12-based para detectar o ácido nucleico qual foi denominado como DETECTR (ou o repórter endonuclease-visado ADN do transporte de CRISPR). Usando este método, os vários vírus de DNA/RNA, os genótipo virais, e os únicos polimorfismo humanos do nucleotide podem ser detectados dentro de uma hora das linha celular ou das amostras clínicas com sensibilidade alta.

DETECTR pode igualmente detectar e discriminar vários genótipo do papillomavirus humano (HPV) nas linha celular humanas contaminadas com vírus ou mesmo em amostras pacientes clínicas. Os Cas 12 e os métodos Cas13 exigem a amplificação de ácidos nucleicos do alvo aumentar a sensibilidade da detecção à concentração do aM. Estes métodos podem igualmente ser usados em combinação com outros métodos da amplificação do ácido nucleico.

Vantagens de sistemas biosensing de CRISPR/Cas

Os sistemas biosensing acima mencionados são simples tornar-se ou para reconstruir, têm um muito de alta resolução que possa detectar variações até o nível de uma única base. Além disso, não há nenhuma exigência de instrumentos adicionais.

Podem ser usados para sistemas diagnósticos do ponto--cuidado e podem igualmente ser personalizados aos vários in vitro media do fato. Porque esta aproximação é tolerante de várias amostras não tratadas e tem um custo muito baixo, pode ser usada para tarefas da selecção da grande escala nos exemplos onde os recursos são limitados.

Limitações de sistemas biosensing de CRISPR/Cas

Quando os effectors de CRISPR, incluindo Cas9 e Cas12, puderem reconhecer e fender todo o lugar do alvo, necessitam seqüências adjacentes do motivo (PAM) do protospacer junto ao ADN dobro-encalhado alvo. Também, o comprimento da seqüência do guia e a posição do local da mutação na seqüência do guia podem influenciar a relação de relação sinal-ruído no método biosensing.

Actualmente, somente o método de SHERLOCK pode ser usado para detectar seqüências múltiplas, e este é restringido demasiado actualmente a quatro alvos. A maioria de métodos biosensing de CRISPR exigem as amostras ser pretreated facilitando a etapa da amplificação e da detecção.

Fontes

Further Reading

Last Updated: Jul 4, 2019

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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