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Aplicaciones de los sistemas de CRISPR/Cas Biosensing

El sistema de CRISPR/Cas 9 se está empleando extensamente para corregir genes en sistemas mamíferos. Sin embargo, recientemente, la enzima Cas9 ha demostrado potencial como biosensor, y los diversos determinantes del Cas ahora se están aplicando a los diagnósticos moleculares.

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Sistema CRISPR-Cas9ibreakstock | Shutterstock

Tipos de los sistemas biosensing CRISPR/Cas9

Cas9 es una de las enzimas dominantes del sistema CRISPR-Cas9 donde actúa como molecular scissor cortando los dos cabos de la DNA en los puntos específicos en el genoma. Esto se ejecuta con la ayuda de un ARN de la guía que ate a la DNA y a las “guías” Cas9 a la región correcta. Este sistema se está utilizando actualmente para crear un sistema biosensing.

Más concretamente, el Cas9 nucleasa-desactivado (dCas9) todavía conserva su capacidad de atar a la DNA doble-trenzada objetivo. Por lo tanto, esta enzima se puede acoplar con los diversos reporteros, tales como proteína de la hendidura o enzima fluorescente de la hendidura para crear un módulo biosensing.  Cuando dCas9 ata al ácido nucléico del objetivo, causa la reintegración de la proteína o de la enzima fluorescente de la hendidura, llevando a la fluorescencia esa socorros en la detección de señal.

Actualmente, hay tres tipos de sistemas biosensing determinante-relacionados del Cas que prometan rupturas sustanciales en diagnósticos de CRISPR: dCas9 determinante-basó el sistema, el sistema de dCas12-effector-based, y el sistema determinante-basado dCas13.

dCas9

La combinación de Cas9 y de la amplificación del ácido nucléico se puede utilizar para descubrir series específicas del ácido nucléico. Esto se puede utilizar posteriormente a los patógeno del genotipo; por ejemplo, un estudio reciente combinó la amplificación del ácido nucléico y el determinante (NASBA) Cas9 para descubrir y el virus basados serie de Zika del genotipo.

Esta aproximación podía aumentar la especificidad hasta una única base. También, el ARN de la guía fue diseñado para contener un único presente del polimorfismo (SNP) del nucleótido solamente en el genoma del americano, pero no del africano Zika. Por lo tanto, este método podía distinguir correctamente diversos genotipos del virus de Zika.

Cas13

El Cas13 es un RNAase que pertenece al tipo sistema de IV CRISPR/Cas. Contiene los dominios nucleótido-obligatorios del eucariota dos y del prokaryote (HEPN). El Cas 13 también tiene funciones no-canónicas donde la enzima transforma en el endonuclease con las propiedades de degradación del ARN del único cabo. Esta propiedad de Cas13 se llama como actividad colateral de la hendidura.

El primer biosensor basado CRISPR/Cas13 fue desarrollado por Gootenberg y los colegas. Este método se llama SHERLOCK (o reportero enzimático de la alta sensibilidad específica que abre) y tiene el potencial de descubrir objetivos de la DNA y del ARN en una resolución de la único-base.

Este sistema se ha utilizado para descubrir dengue y virus de Zika, los aislantes bacterianos, los genes resistentes a los antibióticos, las mutaciones del cáncer, y los genotipos humanos de la DNA. Cas13a y Cas13b fueron encontrados para exhibir propiedades colaterales de la hendidura del ARN.

Cas12

Aparte de Cas13, el Cas 12a también tiene actividad colateral de la hendidura. Sin embargo, en contraste con los determinantes Cas13, los determinantes Cas12 hienden la DNA de una sola fila en el transporte. El primer caso de la hendidura del transporte de la hendidura de una sola fila de la DNA y de su uso de descubrir los ácidos nucléicos fue mostrado en China en 2017. Este método fue llamado como HOLMES (sistema muy eficiente multiusos de una hora del bajo costo de r).

Durante este período, otro grupo de investigación en América mostró un método similar de Cas12-based para detectar el ácido nucléico cuál fue llamado como DETECTR (o reportero endonuclease-apuntado DNA del transporte de CRISPR). Usando este método, los diversos virus de DNA/RNA, los genotipos virales, y los únicos polimorfismos humanos del nucleótido pueden ser descubiertos dentro de una hora de variedades de células o de muestras clínicas con alta sensibilidad.

DETECTR puede también descubrir y discriminar diversos genotipos del papillomavirus humano (HPV) en las variedades de células humanas infectadas con el virus o aún en muestras pacientes clínicas. Los Cas 12 y los métodos Cas13 requieren la amplificación de los ácidos nucléicos del objetivo aumentar la sensibilidad de la detección a la concentración de la AM. Estos métodos se pueden también utilizar conjuntamente con otros métodos de la amplificación del ácido nucléico.

Ventajas de los sistemas biosensing de CRISPR/Cas

Los sistemas biosensing ya mencionados son simples convertirse o reconstruir, tienen un muy de alta resolución que pueda descubrir variaciones hasta el nivel de una única base. Además, no hay requisito de instrumentos adicionales.

Pueden ser utilizados para los sistemas diagnósticos del punto-de-cuidado y pueden también ser modificados para requisitos particulares para adaptarse a diversos ambientes ines vitro. Pues esta aproximación es tolerante de diversas muestras no tratadas y tiene un costo muy bajo, puede ser utilizada para las tareas de la investigación del gran escala en casos donde están limitados los recursos.

Limitaciones de los sistemas biosensing de CRISPR/Cas

Mientras que los determinantes de CRISPR, incluyendo Cas9 y Cas12, pueden reconocer y hender cualquier situación del objetivo, necesitan series adyacentes del adorno (PAM) del protospacer adyacente a la DNA doble-trenzada objetivo. También, el largo de la serie de la guía y la posición del sitio de la mutación en la serie de la guía pueden influenciar el ratio señal/ruido en el método biosensing.

Actualmente, solamente el método de SHERLOCK se puede utilizar para descubrir series múltiples, y esto se restringe también actualmente a cuatro objetivos. La mayoría de los métodos biosensing de CRISPR requieren las muestras ser pretratados para facilitar el paso de la amplificación y de la detección.

Fuentes

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Last Updated: Jul 4, 2019

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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