Utilisant l'électroperméabilisation pour transformer des bactéries, protoplastes de levure et de centrale

L'électroperméabilisation est une technologie employée pour augmenter la perméabilité des membranes cellulaires. Elle est employée pour inciter des cellules à reprendre un grand choix de substances, y compris des produits chimiques, des médicaments, et l'ADN.

Crédit : Rattiya Thongdumhyu/Shutterstock.com

Quand les cellules reprennent l'ADN, le procédé est connu comme transformation. Les bactéries, la levure, et les protoplastes de centrale peuvent être transformés utilisant l'électroperméabilisation.

Quel est un electroporator ?

Un electroporator est un dispositif qui retient la suspension de cellules tandis que la tension est appliquée. La suspension de cellules est mise dans un récipient spécialisé, ou la cuvette, avec deux électrodes en aluminium de chaque côté. Les électrodes doivent entrer en contact avec la suspension de cellules.

L'électroperméabilisation mène à la formation des pores dans la membrane cellulaire. Les pouls électriques, autour de 0.5-1V, sont appliqués en travers de la membrane, agissant en tant que condensateur pour le transfert des ions de la solution. Ceci induit un réarrangement de la structure de lipide de la membrane, formant d'abord un pré-pore, puis un pore conducteur par dont l'ADN peut réussir.

Bactéries

La transformation des bactéries comporte habituellement l'utilisation des plasmides. Les plasmides sont des éléments circulaires d'ADN qui peuvent transporter des gènes à copier et d'autres fonctionnements désirés pour l'expression de la protéine. Un courant est réussi par les cellules suspendues contenant le plasmide ADN dans une cuvette. On permet alors aux les cellules de se développer et se diviser, reproduisant l'élément d'ADN.

Dans un protocole typique d'électroperméabilisation, une transformation positive de contrôle est au commencement effectuée utilisant le plasmide non coupé ADN, et un contrôle négatif sans l'ADN. Le plasmide contient un facteur de choix, tel que la résistance aux antibiotiques, qui permet aux cellules donnantes droit d'être interviewées. L'échantillon témoin positif devrait se développer et l'échantillon témoin négatif devrait montrer l'absence de croissance.

On choisit des cellules hôte compatibles qui ont les propriétés désirées pour la transformation. L'électroperméabilisation est effectuée avec les échantillons expérimentaux. Si couronné de succès, l'élément désiré d'ADN peut être moissonné des cellules.

Levure

Les cellules de levure type ont limité le rendement de transformation. Un protocole pour la transformation optimisée de levure comprend une combinaison de l'acétate de lithium et du dithiothreitol (LiAc/SS) comme agents de révision de cellules. Ces produits chimiques améliorent la transformation de levure par électroperméabilisation.

Les chercheurs ont également inclus le chlorure de sorbitol et de calcium dans le tampon d'électroperméabilisation. Ces modifications ont eu comme conséquence le volume accru de cellules qui a pu avoir contribué aux résultats d'un rendement plus élevé de transformation. Les quantités croissantes d'ADN ont également eu comme conséquence le rendement accru de transformation.

Un autre protocole de transformation de levure nécessite l'utilisation de LiAc/SS, ainsi que le choc de la chaleur. Un pouls à haute tension est administré pendant l'électroperméabilisation aux cellules de levure qui ont été saisies en présence du transporteur monocatenaire ADN, du plasmide ADN, et du polyéthylène glycol (ANCRAGE). Le protocole peut être complété en 30 mn.

Protoplastes de centrale

Des centrales de l'orange douce (C.sinensis) peuvent être régénérées des protoplastes du durillon embryogenic de la centrale. Ce trait a été exploité pour produire de nombreux hybrides.

Les chercheurs ont optimisé le rendement d'électroperméabilisation des protoplastes dérivés d'une lignée cellulaire embryogenic d'orange douce, avant qu'ils electroporated les en présence des éléments conçus pour produire les centrales fluorescentes.

Par la suite, ils ont régénéré les durillons protoplaste-dérivés dans des centrales. Ceci fonctionne explique l'installation et la souplesse d'utilisation de la technique d'électroperméabilisation dans des protoplastes de centrale.

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Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Catherine Shaffer

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Dr. Catherine Shaffer

Catherine Shaffer is a freelance science and health writer from Michigan. She has written for a wide variety of trade and consumer publications on life sciences topics, particularly in the area of drug discovery and development. She holds a Ph.D. in Biological Chemistry and began her career as a laboratory researcher before transitioning to science writing. She also writes and publishes fiction, and in her free time enjoys yoga, biking, and taking care of her pets.

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