Usando o Electroporation para transformar os protoplastas das bactérias, do fermento e da planta

O Electroporation é uma tecnologia usada para aumentar a permeabilidade das membranas de pilha. É usado para induzir pilhas para pegar uma variedade de substâncias, incluindo produtos químicos, drogas, e ADN.

Crédito: Rattiya Thongdumhyu/Shutterstock.com

Quando as pilhas pegam o ADN, o processo está sabido como a transformação. As bactérias, o fermento, e os protoplastas da planta podem ser transformados usando o electroporation.

Que é um electroporator?

Um electroporator é um dispositivo que guardare a suspensão da pilha quando a tensão for aplicada. A suspensão da pilha é posta em um recipiente especializado, ou na cubeta, com os dois eléctrodos de alumínio de cada lado. Os eléctrodos devem entrar o contacto com a suspensão da pilha.

O Electroporation conduz à formação de poros dentro da membrana de pilha. Os pulsos elétricos, em torno de 0.5-1V, são aplicados através da membrana, actuando como um capacitor para a migração dos íons da solução. Isto induz um rearranjo da estrutura do lipido da membrana, formando primeiramente um pre-poro, a seguir um poro condutor através de que o ADN pode passar.

Bactérias

A transformação das bactérias envolve geralmente o uso dos plasmídeo. Os plasmídeo são as construções circulares do ADN que podem levar os genes a ser clonados e outras funções desejadas para a expressão da proteína. Uma corrente é passada através das pilhas suspendidas que contêm o ADN do plasmídeo em uma cubeta. As pilhas são permitidas então crescer e dividir-se, reproduzindo a construção do ADN.

Em um protocolo típico do electroporation, uma transformação positiva do controle é realizada inicialmente usando o ADN sem cortes do plasmídeo, e um controle negativo sem o ADN. O plasmídeo contem um factor da selecção, tal como a resistência antibiótica, que permite que as pilhas resultantes sejam seleccionadas. A amostra de controle positiva deve crescer e a amostra de controle negativa deve não mostrar nenhum crescimento.

As pilhas de anfitrião compatíveis são escolhidas que têm as propriedades desejadas para a transformação. O Electroporation é realizado com as amostras experimentais. Se bem sucedida, a construção desejada do ADN pode ser colhida das pilhas.

Fermento

As pilhas de fermento tipicamente limitaram a eficiência da transformação. Um protocolo para a transformação aperfeiçoada do fermento inclui uma combinação do acetato do lítio e do dithiothreitol (LiAc/SS) como agentes de acondicionamento da pilha. Estes produtos químicos aumentam a transformação do fermento pelo electroporation.

Os pesquisadores igualmente incluíram o cloreto do sorbitol e de cálcio no amortecedor do electroporation. Estas mudanças conduziram ao volume aumentado da pilha que pode ter contribuído ao resultado de uma eficiência mais alta da transformação. As quantidades crescentes de ADN igualmente conduziram à eficiência aumentada da transformação.

Um outro protocolo da transformação do fermento chama para o uso de LiAc/SS, assim como choque do calor. Um pulso de alta tensão é administrado durante o electroporation às pilhas de fermento que foram calor chocado na presença do ADN único-encalhado do portador, ADN do plasmídeo, e glicol de polietileno (PEG). O protocolo pode ser terminado em 30 minutos.

Protoplastas da planta

As plantas da laranja doce (C.sinensis) podem ser regeneradas dos protoplastas do calo embryogenic da planta. Este traço foi explorado para produzir híbrido numerosos.

Os pesquisadores aperfeiçoaram a eficiência do electroporation dos protoplastas derivados de uma linha celular embryogenic da laranja doce, antes que electroporated os na presença das construções projetadas produzir plantas fluorescentes.

Subseqüentemente, regeneraram calo protoplasta-derivados em plantas. Isto trabalha demonstra o serviço público e a versatilidade da técnica do electroporation nos protoplastas da planta.

Fontes:

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Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Catherine Shaffer

Written by

Dr. Catherine Shaffer

Catherine Shaffer is a freelance science and health writer from Michigan. She has written for a wide variety of trade and consumer publications on life sciences topics, particularly in the area of drug discovery and development. She holds a Ph.D. in Biological Chemistry and began her career as a laboratory researcher before transitioning to science writing. She also writes and publishes fiction, and in her free time enjoys yoga, biking, and taking care of her pets.

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