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Utilisant la cytométrie de flux pour regarder la signalisation de Paracrine

Les cellules produisent les types variés de vésicules extracellulaires (EVs) qui servent à la transmission à courte portée de cellule-à-cellule dans nos fuselages. Car ces EVs sont habituellement moins d'un micromètre dans la taille, l'identification de différents types d'EV peut être un défi.

cytométrie de fluxCrédit d'image : Kateryna Kon/Shutterstock.com

Cependant, les dernières méthodes (FC) de cytométrie de flux sont hautement adaptées pour l'analyse de différentes populations d'EV. Les chercheurs d'Italie ont récent présenté leur méthode optimisée pour l'analyse de FC des vésicules extracellulaires des cellules souche mésenchymateuses humaines (MSCs) dans une protocole-publication, pour partager les pratiques avec d'autres chercheurs.

Ce protocole a été publié dans les protocoles actuels de tourillon dans la biologie de cellule souche.

La transmission entre les cellules dans un organisme est principale pour combiner l'activité cellulaire entre différents tissus. Une voie de transmission réputée est représentée par le système endocrinien, où, par exemple, des hormones sont relâchées par les tissus spécialisés pour combiner différents organes dans le fuselage.

Sans compter que la signalisation endocrinienne, le système de paracrine transmet l'information entre les cellules sur les gammes courtes par l'intermédiaire des vésicules extracellulaires. Ces EVs sont des vésicules biomembrane-ci-jointes qui contiennent des protéines et d'autres biomolécules, et les protéines spécifiques de membrane qui atteignent à l'extérieur peuvent particulièrement agir l'un sur l'autre avec d'autres cellules.

Il y a au moins trois sous-types différents d'EVs, nommés des exosomes, de microvesicles, et de fuselages d'apoptotique. Tandis que leurs différents fonctionnements physiologiques ne sont pas entièrement compris, on l'a observé que l'EVs différent diffèrent dans leurs tailles et densités.

Les différentes caractéristiques structurelles des sous-types d'EV offrent une voie de les séparer entre eux, pour entreprendre des études approfondies de leurs fonctionnements. la séparation Densité-dépendante d'EVs par l'ultracentrifugation permet l'analyse suivante d'EV par cytométrie de flux (FC), et un organisme de recherche italien abouti par M. Roberta Tasso (Gênes) a récent partagé leur méthode optimisée de purification d'EV dans un protocole détaillé.

Séparant les vésicules extracellulaires basées sur la densité

Les cellules souche mésenchymateuses d'isolement dans les cultures in vitro sécrètent les vésicules extracellulaires dans leur milieu de culture. EVs peut être rassemblé du milieu de culture par l'ultracentrifugation de densité-gradient, où les différents sous-types d'EV sont séparés selon leur densité.

Par la suite, la présence d'EVs dans la solution de densité-gradient peut être déterminée en mesurant l'indice de réfraction (RI) de la solution, car l'EVs entraînera une modification du RI.

Optimiser la cytométrie de flux pour l'analyse d'EV

Une fois qu'EVs sont isolés basait sur leur densité, cytométrie de flux peut être employé pour caractériser les différentes populations de sous-type d'EV. Cependant, car EVs sont plutôt petit (moins d'un micromètre de diamètre), l'étalonnage complet de l'instrument est un préalable à une analyse instructive.

Les chercheurs italiens décrivent leurs pratiques dans l'étalonnage de FC, et les exemples de présent d'EV analyse qui expliquent leur capacité de déterminer exactement la concentration et les tailles des populations d'EV.

Une force principale des méthodes courantes de cytométrie de flux est que des cellules entières, ou l'EVs peuvent être marqués basé sur les caractéristiques extérieures caractéristiques, telles que la présence des protéines particulières de membrane. Des anticorps spécifiques, conjugués aux molécules fluorescentes, peuvent être employés pour marquer EVs avec une configuration extérieure spéciale. Les exemples actuels de scientifiques pour anticorps-gripper à trois protéines de membrane, mesurés sur EVs épuré.

La séparation et l'analyse de FC de différentes populations d'EV permettent clairement une enquête plus en profondeur sur les fonctionnements de paracrine d'EVs dans la signalisation de cellule-à-cellule.

Avec la méthodologie publiée, qui est assez facile à utiliser dans la plupart des laboratoires normaux pour des cellule-études, les pratiques peuvent être partagées pour piloter la recherche en rendant la recherche expérimentale de différents laboratoires plus comparable et reproductible.

Sources

La caractérisation d'isolement de Gorgun C et autres et de cytométrie de fl aïe des sous-populations d'extracellulaire-vésicule a dérivé des cellules stromales mésenchymateuses humaines. Protocoles actuels dans la biologie de cellule souche 2019, 48, e76 ; DOI : 10.1002/cpsc.76.

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Last Updated: Nov 11, 2019

Dr. Christian Zerfaß

Written by

Dr. Christian Zerfaß

Christian is an enthusiastic life scientist who wants to understand the world around us. He was awarded a Ph.D. in Protein Biochemistry from Johannes Gutenberg University in Mainz, Germany, in 2015, after which he moved to Warwick University in the UK to become a post-doctoral researcher in Synthetic Biology.

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