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Facendo uso di citometria a flusso per esaminare segnalazione di Paracrine

Le celle producono i vari tipi di vescicole extracellulari (EVs) che serviscono per la comunicazione a corta portata della cella--cella nei nostri organismi. Poichè questo EVs è solitamente meno di un micrometro nella dimensione, l'identificazione dei tipi differenti di EV può essere una sfida.

citometria a flussoCredito di immagine: Kateryna Kon/Shutterstock.com

Tuttavia, gli ultimi metodi (FC) di citometria a flusso sono altamente adatti ad analisi delle popolazioni differenti di EV. I ricercatori dall'Italia recentemente hanno presentato il loro metodo ottimizzato per l'analisi di FC delle vescicole extracellulari dalle cellule staminali mesenchymal umane (MSCs) in una protocollo-pubblicazione, per dividere il best practice con altri ricercatori.

Questo protocollo è stato pubblicato nei protocolli correnti del giornale nella biologia di cellula staminale.

La comunicazione fra le celle in un organismo è chiave coordinare l'attività cellulare fra i tessuti differenti. Un canale di comunicazione ben noto è rappresentato dal sistema endocrino, in cui, per esempio, gli ormoni sono rilasciati dai tessuti specializzati per coordinare gli organi differenti nell'organismo.

Oltre alla segnalazione endocrina, il sistema di paracrine trasmette le informazioni fra le celle sopra i brevi intervalli tramite vescicole extracellulari. Questo EVs è vescicole biomembrane-qui accluse che contengono le proteine ed altre biomolecole e le proteine specifiche della membrana che raggiungono all'esterno possono specificamente interagire con altre celle.

Ci sono almeno tre sottotipi differenti di EVs, definiti exosomes, di microvesicles e degli enti apoptotic. Mentre le loro funzioni fisiologiche differenti completamente non sono capite, è stato osservato che il EVs differente differisce nelle loro dimensioni e densità.

Le funzionalità strutturali differenti dei sottotipi di EV offrono un modo separarli l'uno dall'altro, per intraprendere gli studi approfonditi delle loro funzioni. la separazione Densità-dipendente di EVs dall'ultracentrifugazione permette l'analisi successiva di EV da citometria a flusso (FC) e un gruppo di ricerca italiano piombo dal Dott. Roberta Tasso (Genova) recentemente ha diviso il loro metodo ottimizzato di depurazione di EV in un protocollo dettagliato.

Separando le vescicole extracellulari basate su densità

Le cellule staminali mesenchymal isolate nelle culture in vitro secernono le vescicole extracellulari nel loro terreno di coltura. EVs può essere raccolto dal terreno di coltura dall'ultracentrifugazione di densità-gradiente, dove i sottotipi differenti di EV sono separati secondo la loro densità.

Successivamente, la presenza di EVs nella soluzione di densità-gradiente può essere determinata misurando l'indice di rifrazione (RI) della soluzione, poichè il EVs causerà un cambiamento del RI.

Citometria a flusso d'ottimizzazione per analisi di EV

Una volta che EVs è isolato basasse sulla loro densità, citometria a flusso può essere usato per caratterizzare le diverse popolazioni di sottotipo di EV. Tuttavia, poichè EVs è piuttosto piccolo (meno di un micrometro di diametro), la calibratura accurata dello strumento è un presupposto per un'analisi informativa.

I ricercatori italiani descrivono il loro best practice nella calibratura di FC e gli esempi del presente di EV analizza che dimostrano la loro capacità di determinare esattamente la concentrazione e le dimensioni di popolazioni di EV.

Una resistenza chiave dei metodi comuni di citometria a flusso è che le intere celle, o EVs possono essere contrassegnati in base alle funzionalità di superficie caratteristiche, quale la presenza di proteine particolari della membrana. Gli anticorpi specifici, coniugati alle molecole fluorescenti, possono essere usati per tracciare EVs con una funzionalità di superficie speciale. Gli esempi attuali degli scienziati per l'anticorpo-associazione a tre proteine della membrana, misurati su EVs depurativo.

La separazione e l'analisi di FC di popolazioni differenti di EV permettono chiaramente l'indagine più approfondita sulle funzioni di paracrine di EVs nella segnalazione della cella--cella.

Con la metodologia pubblicata, che è equo di facile impiego nella maggior parte dei laboratori standard per gli cella-studi, il best practice può essere diviso per determinare la ricerca rendendo la ricerca sperimentale dei laboratori differenti più comparabile e riproducibile.

Sorgenti

L'isolamento di Gorgun C et al. e la caratterizzazione di cytometry del ow del fl delle sottopopolazioni della extracellulare-vescicola sono derivato dalle celle stromal mesenchymal umane. Protocolli correnti nella biologia di cellula staminale 2019, 48, e76; DOI: 10.1002/cpsc.76.

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Last Updated: Nov 11, 2019

Dr. Christian Zerfaß

Written by

Dr. Christian Zerfaß

Christian is an enthusiastic life scientist who wants to understand the world around us. He was awarded a Ph.D. in Protein Biochemistry from Johannes Gutenberg University in Mainz, Germany, in 2015, after which he moved to Warwick University in the UK to become a post-doctoral researcher in Synthetic Biology.

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