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Usando o Cytometry de fluxo para olhar a sinalização de Paracrine

As pilhas produzem vários tipos de vesículas extracelulares (EVs) que servem para uma comunicação de curto prazo da pilha-à-pilha em nossos corpos. Porque este EVs é geralmente menos de um micrômetro em tamanho, a identificação de tipos diferentes de EV pode ser um desafio.

cytometry de fluxoCrédito de imagem: Kateryna Kon/Shutterstock.com

Contudo, os métodos os mais atrasados do cytometry (FC) de fluxo são altamente apropriados para a análise de populações diferentes de EV. Os pesquisadores de Itália têm apresentado recentemente seu método aperfeiçoado para a análise de FC das vesículas extracelulares das células estaminais mesenchymal humanas (MSCs) em uma protocolo-publicação, para compartilhar da melhor prática com outros pesquisadores.

Este protocolo foi publicado nos protocolos actuais do jornal na biologia de célula estaminal.

A comunicação entre pilhas em um organismo é chave coordenar a actividade celular entre tecidos diferentes. Um canal de comunicação conhecido é representado pelo sistema de glândula endócrina, onde, por exemplo, as hormonas são liberadas por tecidos especializados para coordenar órgãos diferentes no corpo.

Além da sinalização da glândula endócrina, o sistema do paracrine transmite a informação entre pilhas sobre escalas curtos através das vesículas extracelulares. Este EVs é as vesículas biomembrane-incluidas que contêm proteínas e outras biomoléculas, e as proteínas específicas da membrana que alcançam à parte externa podem especificamente interagir com outras pilhas.

Há pelo menos três subtipos diferentes de EVs, denominados exosomes, de microvesicles, e de corpos apoptotic. Quando suas funções fisiológicos diferentes não forem compreendidas inteiramente, observou-se que o EVs diferente difere em seus tamanhos e densidades.

As características estruturais diferentes dos subtipos de EV oferecem uma maneira de separá-los de se, para conduzir estudos detalhados de suas funções. a separação Densidade-dependente de EVs pelo ultracentrifugation permite a análise subseqüente de EV pelo cytometry de fluxo (FC), e um grupo de investigação italiano conduzido pelo Dr. Roberta Tasso (Genebra) tem compartilhado recentemente de seu método aperfeiçoado da purificação de EV em um protocolo detalhado.

Separando as vesículas extracelulares baseadas na densidade

As células estaminais mesenchymal isoladas in vitro em culturas segregam as vesículas extracelulares em seu media de cultura. EVs pode ser recolhido do media de cultura pelo ultracentrifugation do densidade-inclinação, onde os subtipos diferentes de EV são separados de acordo com sua densidade.

Subseqüentemente, a presença de EVs na solução do densidade-inclinação pode ser determinada medindo o R.I. (RI) da solução, porque o EVs causará uma mudança do RI.

Cytometry de fluxo de aperfeiçoamento para a análise de EV

Uma vez que EVs é isolado baseou em sua densidade, cytometry de fluxo pode ser usado para caracterizar as populações individuais do subtipo de EV. Contudo, como EVs é um pouco pequeno (menos de um micrômetro no diâmetro), a calibração completa do instrumento é uma condição prévia para uma análise informativa.

Os pesquisadores italianos descrevem sua melhor prática na calibração de FC, e os exemplos do presente de EV analisam que demonstram sua capacidade para determinar exactamente a concentração e os tamanhos de populações de EV.

Uma força chave de métodos comuns do cytometry de fluxo é que as pilhas inteiras, ou EVs podem ser etiquetados com base em características da superfície da característica, tais como a presença de proteínas particulares da membrana. Os anticorpos específicos, conjugados às moléculas fluorescentes, podem ser usados para marcar EVs com uma característica de superfície especial. Os exemplos actuais dos cientistas para anticorpo-ligar a três proteínas da membrana, medidos em EVs refinado.

A separação e a análise de FC de populações diferentes de EV permitem claramente uma investigação mais detalhada das funções do paracrine de EVs na sinalização da pilha-à-pilha.

Com a metodologia publicada, que é razoavelmente fácil de usar na maioria de laboratórios padrão para pilha-estudos, a melhor prática pode ser compartilhada para conduzir a pesquisa fazendo a pesquisa experimental de laboratórios diferentes mais comparável e reprodutível.

Fontes

O isolamento de Gorgun C e outros e a caracterização do cytometry do ow do fl de subpopulações da extracelular-vesícula derivaram-se das pilhas stromal mesenchymal humanas. Protocolos actuais na biologia de célula estaminal 2019, 48, e76; DOI: 10.1002/cpsc.76.

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Last Updated: Nov 11, 2019

Dr. Christian Zerfaß

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Dr. Christian Zerfaß

Christian is an enthusiastic life scientist who wants to understand the world around us. He was awarded a Ph.D. in Protein Biochemistry from Johannes Gutenberg University in Mainz, Germany, in 2015, after which he moved to Warwick University in the UK to become a post-doctoral researcher in Synthetic Biology.

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