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Usando el Cytometry de flujo para observar la transmisión de señales de Paracrine

Las células producen los diversos tipos de vesículas extracelulares (EVs) que sirvan para la comunicación de corto alcance de la célula-a-célula en nuestras carrocerías. Pues este EVs es generalmente menos de un micrómetro de tamaño, la identificación de diversos tipos de EV puede ser un reto.

cytometry de flujoHaber de imagen: Kateryna Kon/Shutterstock.com

Sin embargo, los últimos métodos del cytometry (FC) de flujo son altamente convenientes para el análisis de diversas poblaciones de EV. Los investigadores de Italia han presentado recientemente su método optimizado para el análisis de FC de vesículas extracelulares de las células madres mesenquimales humanas (MSCs) en una protocolo-publicación, para compartir mejor práctica con otros investigadores.

Este protocolo se ha publicado en los protocolos actuales del gorrón en biología de célula madre.

La comunicación entre las células en un organismo es dominante coordinar la actividad celular entre diversos tejidos. Un canal de comunicaciones bien conocido es representado por el sistema endocrino, donde, por ejemplo, las hormonas son liberadas por los tejidos especializados para coordinar diversos órganos en la carrocería.

Además de la transmisión de señales endocrina, el sistema del paracrine transmite la información entre las células sobre alcances cortos vía las vesículas extracelulares. Este EVs es las vesículas biomembrane-cubiertas que contienen las proteínas y otras biomoléculas, y las proteínas específicas de la membrana que alcanzan al exterior pueden obrar recíprocamente específicamente con otras células.

Hay por lo menos tres diversos subtipos de EVs, llamados los exosomes, de microvesicles, y de carrocerías apoptotic. Mientras que sus diversas funciones fisiológicas no se entienden completo, se ha observado que el diverso EVs difiere en sus tallas y densidades.

Las diversas características estructurales de los subtipos de EV ofrecen una manera de separarlos de uno a, para conducto estudios profundizados de sus funciones. la separación Densidad-relacionada de EVs por la ultracentrifugación permite análisis subsiguiente de EV por cytometry de flujo (FC), y un grupo de investigación italiano llevado por el Dr. Roberta Tasso (Génova) ha compartido recientemente su método optimizado de la purificación de EV en un protocolo detallado.

Separando las vesículas extracelulares basadas en densidad

Las células madres mesenquimales aisladas en culturas ines vitro secretan las vesículas extracelulares en su medio de cultivo. EVs se puede cerco del medio de cultivo por la ultracentrifugación del densidad-gradiente, donde los diversos subtipos de EV se separan según su densidad.

Posteriormente, la presencia de EVs en la solución del densidad-gradiente puede ser determinada midiendo el índice de refracción (RI) de la solución, pues el EVs causará un cambio del RI.

Cytometry de flujo óptimo para el análisis de EV

Una vez que se aísla EVs basó en su densidad, cytometry de flujo se puede utilizar para caracterizar las poblaciones individuales del subtipo de EV. Sin embargo, como EVs es bastante pequeño (menos de un micrómetro en diámetro), la calibración completa del instrumento es un requisito previo para un análisis informativo.

Los investigadores italianos describen su mejor práctica en la calibración de FC, y los ejemplos del presente de EV analizan que demuestren su capacidad de determinar exacto la concentración y las tallas de las poblaciones de EV.

Una fuerza dominante de los métodos comunes del cytometry de flujo es que las células enteras, o EVs se pueden etiqueta sobre la base de características superficiales características, tales como la presencia de proteínas determinadas de la membrana. Los anticuerpos específicos, conjugados a las moléculas fluorescentes, se pueden utilizar para marcar EVs con una característica superficial especial. Los actuales ejemplos de los científicos para anticuerpo-atar a tres proteínas de la membrana, medidos en EVs purificado.

La separación y el análisis de FC de diversas poblaciones de EV permiten sin obstrucción una investigación más profundizada de las funciones del paracrine de EVs en la transmisión de señales de la célula-a-célula.

Con la metodología publicada, que es bastante fácil de utilizar en la mayoría de los laboratorios estándar para los célula-estudios, la mejor práctica se puede compartir para impulsar la investigación haciendo la investigación experimental de diversos laboratorios más comparable y reproductiva.

Fuentes

El aislamiento de Gorgun C y otros y la caracterización del cytometry del ow del fl de las subpoblaciones de la extracelular-vesícula derivaron de las células stromal mesenquimales humanas. Protocolos actuales en la biología de célula madre 2019, 48, e76; DOI: 10.1002/cpsc.76.

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Last Updated: Nov 11, 2019

Dr. Christian Zerfaß

Written by

Dr. Christian Zerfaß

Christian is an enthusiastic life scientist who wants to understand the world around us. He was awarded a Ph.D. in Protein Biochemistry from Johannes Gutenberg University in Mainz, Germany, in 2015, after which he moved to Warwick University in the UK to become a post-doctoral researcher in Synthetic Biology.

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