Utilisant la microscopie à fluorescence pour étudier des protéines

L'avènement de la microscopie à fluorescence a permis pour concevoir les cellules sous tension d'intérieur de protéines. C'est particulièrement utile en étudiant l'emplacement des voies de signalisation et des associés obligatoires.

Un échantillon de tumeur où les niveaux de différentes protéines dans les populations cellulaires ont été recensés utilisant un anticorps fluorescent marqué - par Karl Dupont

Un échantillon de tumeur où les niveaux de différentes protéines dans les populations cellulaires ont été recensés utilisant un anticorps et une microscopie à fluorescence fluorescent marqués. (Karl Dupont | Shutterstock)

Étude de la localisation de protéine

Le fonctionnement d'une protéine peut être impliqué par sa localisation, en particulier quand une voie de signalisation est connue. L'emplacement de la protéine peut être déterminé par l'utilisation des protéines recombinées protégées par fusible avec une molécule de journaliste, des teintures fluorescentes, ou des anticorps fluorescents de protéine-détail.

Des protéines fluorescentes recombinées avec de la protéine cible ou les régions de réglementation peuvent overexpressed à l'intérieur des cellules pour comprendre des processus cellulaires principaux. Un avantage d'employer les systèmes génétiques pour exprimer des protéines est que les protéines fluorescentes peuvent être sélecteur activées dans certaines régions des tissus ou des cellules. Ceci, consécutivement, rend le procédé de concevoir des protéines facile.

Étude de la structure des protéines

Les méthodes précédemment utilisées pour étudier la structure des protéines comprennent la microscopie de cryo-électron, la protéine RMN, et la cristallographie de rayon X. Dans la microscopie de cryo-électron, des électrons de haute énergie sont dirigés à l'échantillon pour former une 2D projection. Après la retenue de la 2D orientation des molécules de toutes les cornières, une image 3D est reconstruite. Cependant, ce procédé ne peut pas être exécuté dans les échantillons sous tension et il exige la préparation des échantillons considérable.

D'autre part, la résonance magnétique nucléaire (NMR) capte les propriétés magnétiques et chimiques des atomes mais exige une solution pure de l'échantillon qui n'est de nouveau pas optimal pour étudier des cellules. La cristallographie de rayon X exige de l'échantillon d'être cristallisé avant qu'elle puisse être imagée. Dans ce cas, le procédé de la cristallisation peut modifier la conformation indigène des protéines.

En revanche, les méthodes de superbe-définition, telles que la microscopie photoactivated de localisation (PALM) ou la microscopie d'épuisement d'émission stimulée (STED) ont très un de haute résolution de 20-30 nanomètres. C'est en dessous de la limite de diffraction des microscopes conventionnels (250 nanomètres). Suivre ces méthodes, la structure de protéine et de membrane peut être conçue à un petit groupe grand dans leurs in vivo réglages.

Étude de la dynamique de protéine

Utilisant une guérison fluorescente appelée de méthode après photobleaching ou FRAP, il peut être mesuré comment une protéine déménage ou diffuse à l'intérieur d'une cellule. La diffusion d'une protéine est liée à son état plié ou misfolded, à sa stabilité, et à gripper à d'autres molécules. Ainsi, la compréhension de son mouvement ou diffusion peut aviser pour sa structure et fonctionnement à l'intérieur des cellules.

Dans cette méthode, les molécules fluorescentes dans une région spécifique d'une cellule se blanchissent complet en brillant un faisceau de lumière fort et continuel. Puis, la guérison de la fluorescence dans la région blanchie est mesurée en fonction de l'heure de tracer ses paramètres de diffusion.

Étude de la signalisation et de l'interaction de protéine

C'est déterminé utilisant un transfert d'énergie ou une FRETTE appelé de résonance de Förster de méthode de fluorescence. Dans cette méthode, il y a un transfert d'énergie entre deux molécules commodément attentivement mises donneur appelé et molécules d'accepteur.

Le chromophore de distributeur est au commencement dans une condition enthousiaste et car il est proche dans la proximité à une autre molécule, il transfère son énergie à un chromophore de distributeur. Ce transfert est, ainsi, proportionnel au sixième pouvoir de la distance entre le donneur et l'accepteur.

Par conséquent, basé sur le rendement du transfert de l'énergie, la distance entre deux molécules ou des domaines de protéine peut être impliquée. Ceci permet à des scientifiques de déterminer quels domaines de protéine agissent l'un sur l'autre pendant un événement de signalisation.

Étude des taux de protéine

Indépendamment de la signalisation, de la structure, et du fonctionnement, la fluorescence d'une protéine peut également être employée pour mesurer les niveaux d'une protéine exprimée à l'intérieur d'une cellule ou d'un tissu. Ceci peut être employé dans les cas où la sonde fluorescente est recombinée avec le gène ou le journaliste d'un gène. L'expression du journaliste, dans ce cas, réfléchit les niveaux de la protéine qu'elle est recombinée avec.

Last Updated: Nov 28, 2018

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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