Facendo uso di microscopia di fluorescenza per studiare le proteine

L'arrivo di microscopia di fluorescenza ha permesso di prevedere le celle in tensione dell'interno delle proteine. Ciò è particolarmente utile quando studia la posizione delle vie di segnalazione e dei partner obbligatori.

Un campione del tumore in cui i livelli di proteine differenti nelle popolazioni delle cellule sono stati identificati facendo uso di un anticorpo fluorescente contrassegnato - da Carl Du Pont

Un campione del tumore in cui i livelli di proteine differenti nelle popolazioni delle cellule sono stati identificati facendo uso di una microscopia fluorescente contrassegnata di fluorescenza e dell'anticorpo. (Carl Du Pont | Shutterstock)

Studio della localizzazione della proteina

La funzione di una proteina può essere arguita tramite la sua localizzazione, specialmente quando una via di segnalazione è conosciuta. La posizione della proteina può essere risoluta con l'uso delle proteine recombinanti fuse con una molecola del reporter, le tinture fluorescenti, o gli anticorpi fluorescenti proteina-specifici.

Le proteine fluorescenti ricombinate con proteina bersaglio o le regioni regolarici possono essere overexpressed dentro le celle per capire i trattamenti cellulari fondamentali. Un vantaggio di usando i sistemi genetici per esprimere le proteine è che le proteine fluorescenti possono essere attivate selettivamente in determinate regioni di tessuti o di celle. Ciò, a sua volta, rende il trattamento di visualizzazione delle proteine facile.

Studio della struttura della proteina

I metodi precedentemente impiegati per studiare la struttura della proteina comprendono la microscopia, la proteina RMN e la cristallografia a raggi x dell'cryo-elettrone. Nella microscopia dell'cryo-elettrone, gli elettroni dell'alta energia sono diretti al campione per formare una 2D proiezione. Dopo la cattura del 2D orientamento delle molecole da tutti gli angoli, un'immagine 3D è ricostruita. Tuttavia, questo trattamento non può essere eseguito in campioni in tensione e richiede l'esteso preparato del campione.

D'altra parte, i bloccaggi a risonanza magnetica (NMR) nucleari i beni magnetici e chimici degli atomi ma richiede una soluzione pura del campione che non è ancora ottimale per lo studio delle celle. La cristallografia a raggi x richiede il campione di essere cristallizzata prima che possa essere imaged. In questo caso, il trattamento di cristallizzazione può alterare la conformazione indigena delle proteine.

Al contrario, i metodi di super-risoluzione, quali microscopia photoactivated della localizzazione (PALMA) o microscopia di svuotamento dell'emissione stimolata (STED) hanno molto un di alta risoluzione di 20-30 nanometri. Ciò è sotto il limite di diffrazione dei microscopi convenzionali (250 nanometri). Facendo uso di questi metodi, la struttura della membrana e della proteina può essere visualizzata ad un grande dettaglio nelle loro in vivo impostazioni.

Studio della dinamica della proteina

Facendo uso di un metodo chiamato ripristino fluorescente dopo avere photobleaching o FRAP, può essere misurato come una proteina si muove o si diffonde dentro una cella. La diffusione di una proteina è collegata con il suo stato profilatura o misfolded, la sua stabilità e legare ad altre molecole. Quindi, capire il suo moto o diffusione può informare quanto alla sue struttura e funzione dentro le celle.

In questo metodo, le molecole fluorescenti in una regione specifica di cella completamente sono candeggiate splendendo un fascio luminoso intenso e costante. Poi, il ripristino della fluorescenza nella regione candeggiata è misurato in funzione di tempo di mappare i sui parametri della diffusione.

Studio segnalazione e dell'interazione della proteina

Ciò è risoluta facendo uso di un metodo della fluorescenza chiamato trasferimento o CERCHIO di energia di risonanza di Förster. In questo metodo, c'è un trasferimento di energia fra due molecole molto attentamente collocate donatore e molecole convenientemente chiamati del ricettore.

Il cromoforo erogatore è inizialmente in uno stato eccitato e poichè è vicino nella vicinanza di un'altra molecola, trasferisce la sua energia ad un cromoforo erogatore. Questo trasferimento è, così, proporzionale alla sesta potenza della distanza fra il donatore ed il ricettore.

Quindi, in base al risparmio di temi del trasferimento di energia, la distanza fra due molecole o i domini della proteina può essere arguito. Ciò permette che gli scienziati determinino quali domini della proteina stanno interagendo durante l'evento di segnalazione.

Studio dei livelli della proteina

Oltre alla segnalazione, alla struttura ed alla funzione, la fluorescenza di una proteina può anche essere usata per misurare i livelli di proteina espressa dentro una cella o un tessuto. Ciò può essere usata nei casi in cui la sonda fluorescente è ricombinata con il gene o il reporter di un gene. L'espressione del reporter, in questo caso, riflette i livelli di proteina che è ricombinata con.

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Last Updated: Nov 28, 2018

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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