Usando a microscopia de fluorescência para estudar proteínas

O advento da microscopia de fluorescência tornou possível visualizar pilhas vivas do interior das proteínas. Isto é particularmente útil ao estudar o lugar de caminhos da sinalização e de sócios obrigatórios.

Uma amostra do tumor onde os níveis de proteínas diferentes em populações da pilha fossem identificados usando um anticorpo fluorescente etiquetado - por Carl Du Pont

Uma amostra do tumor onde os níveis de proteínas diferentes em populações da pilha fossem identificados usando uma microscopia fluorescente etiquetada do anticorpo e de fluorescência. (Carl Du Pont | Shutterstock)

Estudando a localização da proteína

A função de uma proteína pode ser pressupor por sua localização, particularmente quando um caminho da sinalização é. O lugar da proteína podido ser determinado com o uso das proteínas de recombinação fundidas com uma molécula do repórter, umas tinturas fluorescentes, ou uns anticorpos fluorescentes proteína-específicos.

As proteínas fluorescentes recombined com proteína do alvo ou regiões reguladoras podem ser overexpressed dentro das pilhas para compreender processos celulares fundamentais. Uma vantagem de usar sistemas genéticos para expressar proteínas é que as proteínas fluorescentes podem selectivamente ser activadas em determinadas regiões de tecidos ou de pilhas. Isto, por sua vez, faz o processo de visualizar proteínas fácil.

Estudando a estrutura da proteína

Os métodos empregados previamente para estudar a estrutura da proteína incluem a microscopia do cryo-elétron, a proteína NMR, e o cristalografia do raio X. Na microscopia do cryo-elétron, os elétrons do de alta energia são dirigidos na amostra para formar uma 2D projecção. Após ter capturado a 2D orientação das moléculas de todos os ângulos, uma imagem 3D é reconstruída. Contudo, este processo não pode ser executado em amostras vivas e exige a preparação extensiva da amostra.

Por outro lado, a ressonância magnética nuclear (NMR) captura as propriedades magnéticas e químicas dos átomos mas exige uma solução pura da amostra que não é outra vez óptima para estudar pilhas. O cristalografia do raio X exige a amostra ser cristalizado antes que possa ser imaged. Neste caso, o processo de cristalização pode alterar a conformação nativa das proteínas.

Ao contrário, os métodos da super-definição, tais como a microscopia photoactivated da localização (PALMA) ou a microscopia da prostração da emissão estimulada (STED) têm um muito de alta resolução de 20-30 nanômetros. Isto está abaixo do limite de difracção de microscópios convencionais (250 nanômetros). Usando estes métodos, a estrutura da proteína e da membrana pode ser visualizada a um grande detalhe em seus in vivo ajustes.

Estudando a dinâmica da proteína

Usando um método chamado recuperação fluorescente após photobleaching ou FRAP, pode ser medido como uma proteína se move ou se difunde dentro de uma pilha. A difusão de uma proteína é relacionada a seu estado dobrado ou misfolded, a sua estabilidade, e à ligação a outras moléculas. Assim, compreender sua movimento ou difusão pode informar a respeito de suas estrutura e função dentro das pilhas.

Neste método, as moléculas fluorescentes em uma região específica de uma pilha são descoradas completamente brilhando um feixe de luz intenso e constante. Então, a recuperação da fluorescência na região descorada é medida em função da hora de traçar seus parâmetros da difusão.

Estudando a sinalização e a interacção da proteína

Isto é determinado usando um método da fluorescência chamado transferência ou FRICÇÃO de energia da ressonância de Förster. Neste método, há transferência de energia entre duas moléculas pròxima colocadas doador e moléculas convenientemente chamados do autómato.

O cromóforo fornecedor está inicialmente em um estado entusiasmado e como é próximo na proximidade a uma outra molécula, transfere sua energia a um cromóforo fornecedor. Esta transferência é, assim, proporcional à sexta potência da distância entre o doador e o autómato.

Daqui, com base na eficiência de transferência de energia, a distância entre duas moléculas ou os domínios da proteína podem ser pressupor. Isto permite que os cientistas determinem que domínios da proteína estão interagindo durante um evento da sinalização.

Estudando níveis da proteína

Independentemente da sinalização, da estrutura, e da função, a fluorescência de uma proteína pode igualmente ser usada para medir os níveis de uma proteína expressada dentro de uma pilha ou de um tecido. Isto pode ser usado nos casos onde a ponta de prova fluorescente recombined com o gene ou o repórter de um gene. A expressão do repórter, neste caso, reflecte os níveis de proteína que recombined com.

Fontes:

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Last Updated: Nov 28, 2018

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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