Usando la microscopia de fluorescencia para estudiar las proteínas

El advenimiento de la microscopia de fluorescencia ha permitido visualizar las células vivas del interior de las proteínas. Esto es determinado útil al estudiar la situación de los caminos de la transmisión de señales y de los socios obligatorios.

Una muestra del tumor donde los niveles de diversas proteínas en poblaciones de la célula han sido determinados usando un anticuerpo fluorescente etiqueta - por Carl Du Pont

Una muestra del tumor donde los niveles de diversas proteínas en poblaciones de la célula se han determinado usando una microscopia fluorescente etiqueta del anticuerpo y de fluorescencia. (Carl Du Pont | Shutterstock)

Estudiar la localización de la proteína

La función de una proteína se puede deducir por su localización, determinado cuando se sabe un camino de la transmisión de señales. La situación de la proteína puede ser resuelta con el uso de las proteínas recombinantes fundidas con una molécula del reportero, tintes fluorescentes, o anticuerpos fluorescentes proteína-específicos.

Las proteínas fluorescentes recombinadas con la proteína del objetivo o las regiones reguladoras se pueden overexpressed dentro de las células para entender procesos celulares fundamentales. Una ventaja de usar sistemas genéticos para expresar las proteínas es que las proteínas fluorescentes se pueden activar selectivamente en ciertas regiones de tejidos o de células. Esto, a su vez, hace el proceso de visualizar las proteínas fácil.

Estudiar la estructura de la proteína

Los métodos empleados previamente para estudiar la estructura de la proteína incluyen microscopia del cryo-electrón, la proteína RMN, y la cristalografía de la radiografía. En microscopia del cryo-electrón, los electrones de alta energía se ordenan en la muestra para formar una 2.a proyección. Después de capturar la 2.a orientación de moléculas de todos los ángulos, se reconstruye una imagen 3D. Sin embargo, este proceso no se puede realizar en muestras vivas y requiere la preparación extensa de la muestra.

Por otra parte, las capturas de resonancia magnética (NMR) nucleares las propiedades magnéticas y químicas de los átomos pero requieren una solución pura de la muestra que no es otra vez óptima para estudiar las células. La cristalografía de la radiografía requiere la muestra ser cristalizada antes de que pueda ser reflejada. En este caso, el proceso de la cristalización puede alterar la conformación nativa de proteínas.

En cambio, los métodos de la estupendo-resolución, tales como microscopia photoactivated de la localización (PALMA) o microscopia del agotamiento de la emisión estimulada (STED) tienen un muy de alta resolución de 20-30 nanómetros. Esto está abajo del límite de difracción de microscopios convencionales (250 nanómetros). Usando estos métodos, la estructura de la proteína y de la membrana se puede visualizar a un gran detalle en sus in vivo fijaciones.

Estudiar dinámica de la proteína

Usando un método llamado recuperación fluorescente después de photobleaching o FRAP, puede ser medido cómo una proteína se mueve o difunde dentro de una célula. La difusión de una proteína se relaciona con su estado doblado o misfolded, su estabilidad, y atar a otras moléculas. Así, la comprensión de su movimiento o difusión puede informar en cuanto a su estructura y función dentro de las células.

En este método, las moléculas fluorescentes en una región específica de una célula son blanqueadas totalmente brillando un haz de luz intenso y constante. Entonces, la recuperación de la fluorescencia en la región blanqueada se mide en función de hora de correlacionar sus parámetros de la difusión.

Estudiar la transmisión de señales y la acción recíproca de la proteína

Esto es resuelto usando un método de la fluorescencia llamado transferencia o TRASTE de energía de resonancia de Förster. En este método, hay una transferencia de la energía entre dos moléculas de cerca colocadas donante y moléculas convenientemente llamados del aceptor.

El cromóforo dispensador de aceite está inicialmente en un estado emocionado y como está cercano en proximidad a otra molécula, transfiere su energía a un cromóforo dispensador de aceite. Esta transferencia es, así, proporcional a la sexta potencia de la distancia entre el donante y el aceptor.

Por lo tanto, sobre la base de la eficiencia de la transferencia de la energía, la distancia entre dos moléculas o los dominios de la proteína puede ser deducida. Esto permite que los científicos determinen qué dominios de la proteína están obrando recíprocamente durante una acción de la transmisión de señales.

Estudiar niveles de la proteína

Aparte de la transmisión de señales, la estructura, y la función, la fluorescencia de una proteína se puede también utilizar para medir los niveles de una proteína expresada dentro de una célula o de un tejido. Esto puede ser utilizada en caso de que la antena fluorescente se recombine con el gen o el reportero de un gen. La expresión del reportero, en este caso, refleja los niveles de proteína que se recombina con.

Fuentes:

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Last Updated: Nov 28, 2018

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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