Utilisant la spectrométrie de masse pour l'analyse de composé de protéine

La spectrométrie de masse (MS) est considérée une méthode puissante pour rapidement et efficacement recensant des échantillons de protéine. La plupart des enjeux cruciaux dans l'analyse du composé de protéine par la milliseconde comprennent la spécificité du composé et des contaminants de protéine en protéine de mouvement propre.

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La purification tandem d'affinité est la méthode la plus recommandée pour augmenter la spécificité de composé de protéine. La purification tandem d'affinité aide en améliorant le rapport signal/bruit par le rétablissement épuré témoin. Aides de marquage de protéine isotopique stable en recensant les contaminants de protéine de mouvement propre et les associés obligatoires.

Les protéines combinent habituellement avec d'autres composantes pour former les composés, la niche ou le transitoire, qui sont impliqués en exerçant des activités biologiques. De plus, certaines des protéines peuvent agir l'un sur l'autre en particulier avec les particules sans protéines, telles que l'ARN ou l'ADN. Ces interactions sont importantes pour le fonctionnement de protéine. En cette condition, la méthode de milliseconde a été employée pour recenser rapidement la composante complexe.

Procédure pour analyser la protéine utilisant la milliseconde

Aujourd'hui, la majorité de l'analyse de la séquence protéique emploie la méthode de milliseconde. Être suivent les certaines des étapes importantes impliquées dans la technique d'analyse de protéine :

  • La première étape impliquée dans l'analyse de protéine est une purification, qui est habituellement exécutée par la chromatographie d'affinité. Après la purification, les composantes du composé de protéine peuvent être séparées utilisant les techniques qui comprennent la mise au point isoélectrique, le SDS-PAGE, ou les différents types de méthode de séparation dans le 2D.

  • Alors les protéines séparées sont vues par la souillure, et pour l'analyse approfondie, elle peut être récupérée. À l'aide de la trypsine, les protéines séparées sont assimilées proteolytically pour produire la combinaison des peptides qui peuvent être déterminés par le spectromètre de masse.
  • Il n'y a aucune nécessité pour la séparation de gel, si l'échantillon a moins complexités. Au lieu de cela, la milliseconde peut être directement appliquée au composé assimilé de protéine. En conclusion, à l'aide des outils appropriés d'informatique, des protéines dans l'échantillon sont figurées à l'extérieur par recombinaison recensée de peptides.
  • Des protéines sont normalement isolées sur un fléau inverse de phase utilisant le gradient d'acétonitrile. Généralement, l'usage de trifluoroacetic dans le solvant intervient avec l'ionisation, qui peut être évitée à l'aide de l'acide acétique. Des peptides qui sont ionisés devraient être mis à jour dans la condition de vapeur. Ceci peut être réalisé en réussissant l'éluat de fléau qui contient le solvant ainsi que les peptides par l'intermédiaire d'un bout fin pour produire de petites gouttelettes.
  • Les peptides ionisés sont mis à jour dans la condition de vapeur, qui se produit après l'évaporation dissolvant. Les surfaces chargées sont permises de transférer le peptide ionisé dans Mme que la chromatographie sm de liquide est une technique dans laquelle des molécules sont transférées dans Mme.
  • Collisionally a activé la dissociation (CAD) ou la dissociation induite de collision (CID) est une approche dans laquelle des peptides sont réduits en fragments aux obligations de peptide en se heurtant elles des molécules de gaz. De ces peptides, prévoyez la masse des éclats. Puisque la milliseconde a deux opérations, telles que la masse de l'éclat de peptide (MSn) et la masse du peptide (MS/MS), existent parfois là deux opérations ou plus pour la fragmentation.
  • Le procédé qui contient ces deux opérations est connu en tant que Mme tandem. Pour déterminer les agencements de peptide, des caractéristiques de masse de l'éclat peuvent être utilisées.
  • Généralement, des caractéristiques peuvent s'analyser utilisant l'ordinateur rivalisant avec des séquences recensées. Le programme très utilisé est SEQUEST. Parfois l'analyse de caractéristiques est faite manuellement pour les séquences neuf introduites et pour la confirmation de quelques autres séquences de canalisation.

Raison derrière les caractéristiques inachevées de séquence protéique

Principalement, 70% de la séquence protéique a observé en voyant le peptide correspondant donne l'analyse couronnée de succès de la protéine. Généralement, 80% de la couverture de séquence protéique est suffisant pour analyser le compte de protéine impliqué dans le transfert d'une cellule à une autre cellule. Les raisons derrière l'analyse qui ne peut pas recenser tous les acides aminés sont cotées ci-dessous :

  • Digestion incorrecte de protéine.
  • À cause de l'hydrophile ou petit dans des passages de peptide de nature par le fléau d'arrière-scène avec du sel ne peut pas s'analyser.
  • En raison de la fragmentation faible, peptides soyez hydrophobe ou trop grand, ne peut pas être retiré du fléau, ou parfois trop grand pour analyser utilisant un spectromètre de masse.
  • Des voies de la fragmentation de peptide ne peuvent pas s'analyser. Cependant, plusieurs spectres sont inexpliqués dans l'enquête.

Empreinte digitale de masse de peptide (PMF)

Cette technique est employée pour l'analyse de la protéine non identifiée. Selon la base de données de la séquence protéique, la complexité impliquée dans l'identification d'une protéine est moins. À l'aide de la modification aidée l'instrument de désorption/ionisation de laser, la masse des peptides qui ne sont pas réduits en fragments, après la digestion de protéine avec de la protéinase ou la trypsine spécifique, peut être estimé. Alors le programme doit comparer les mesures qui sont prévues à partir de la protéine assimilée représentée dans une base de données avec Massachusetts obtenu de peptide.

Cette méthode est appropriée seulement pour des échantillons qui contiennent une protéine unique, ou une paire de protéines de la même abondance. Si la séquence de protéines n'est pas procurable, alors cette méthode ne peut pas être employée. En conclusion, cette méthode a été recommandée comme route pour analyser des échantillons provenant des gels bidimensionnels.

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Last Updated: Feb 26, 2019

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