Facendo uso di spettrometria di massa per analisi del complesso della proteina

La spettrometria di massa (MS) è considerata come un metodo efficace per rapidamente ed efficientemente identificando i campioni della proteina. La maggior parte delle emissioni cruciali nell'analisi del complesso della proteina attraverso il ms comprendono la specificità del complesso e degli agenti inquinanti della proteina in proteina di sfondo.

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La depurazione in tandem di affinità è il metodo raccomandato per aumentare la specificità del complesso della proteina. La depurazione in tandem di affinità aiuta nel miglioramento del rapporto segnale-rumore tramite la generazione depurativa del campione. Guide di contrassegno della proteina isotopica stabile nell'identificazione gli agenti inquinanti della proteina di sfondo e dei partner obbligatori.

Le proteine si combinano solitamente con altre componenti per formare i complessi, stabile o transitorio, che sono compresi nell'esecuzione delle attività biologiche. Inoltre, alcune delle proteine possono interagire specialmente con le particelle senza proteine, quali RNA o DNA. Queste interazioni sono importanti per la funzione della proteina. In questa circostanza, il metodo del ms è stato usato per identificare rapido la componente complessa.

Procedura per analizzare proteina facendo uso del ms

Oggi, la maggior parte dell'analisi della sequenza della proteina usa il metodo del ms. Segue gli alcuni dei punti importanti in questione nella tecnica dell'analisi della proteina:

  • Il primo punto in questione nell'analisi della proteina è depurazione, che è eseguita solitamente dalla cromatografia di affinità. Dopo depurazione, le componenti del complesso della proteina possono essere separate facendo uso delle tecniche che comprendono la messa a fuoco isoelettrica, SDS-PAGE, o i tipi differenti di metodi di separazione nel 2D.

  • Poi le proteine separate sono osservate macchiando e per ulteriore analisi, può essere recuperata. Usando la tripsina, le proteine separate si digeriscono proteolytically per la creazione della combinazione dei peptidi che possono essere determinati dallo spettrometro di massa.
  • Non c'è necessità per la separazione del gel, se il campione ha meno complessità. Invece, il ms può direttamente applicarsi al complesso digerito della proteina. Per concludere, utilizzando gli strumenti appropriati dell'informatica, le proteine nel campione sono capite tramite la ricombinazione identificata dei peptidi.
  • Le proteine sono isolate normalmente su una colonna inversa di fase facendo uso del gradiente dell'acetonitrile. Generalmente, l'uso di trifluoroacetic nel solvente intercede con ionizzazione, che può essere impedita usando l'acido acetico. I peptidi che sono ionizzati dovrebbero essere mantenuti nello stato del vapore. Ciò può essere raggiunta passando l'eluito della colonna che contiene il solvente come pure i peptidi via un suggerimento fine per creare le piccole goccioline.
  • I peptidi ionizzati sono mantenuti nello stato del vapore, che si presenta dopo evaporazione solvente. Le superfici fatte pagare sono permesse trasferire il peptide ionizzato nella sig.ra la cromatografia-ms del liquido che è una tecnica in cui le molecole sono trasferite in sig.ra.
  • Collisionally ha attivato la dissociazione (CAD) o la dissociazione indotta collisione (CID) è un approccio in cui i peptidi sono spezzettati ai legami peptidici scontrandosi loro con le molecole del gas. Da questi peptidi, calcoli la massa dei frammenti. Poiché il ms ha due punti, quale la massa del frammento del peptide (MSn) e la massa del peptide (MS/MS), a volte là esiste due o più punti per frammentazione.
  • Il trattamento che contiene questi due punti è conosciuto come sig.ra in tandem. Per la determinazione delle disposizioni del peptide, i dati di massa del frammento possono essere utilizzati.
  • Generalmente, i dati possono essere analizzati facendo uso del computer che paragona alle sequenze identificate. Il programma ampiamente usato è SEQUEST. A volte l'analisi di dati è fatta manualmente per le sequenze recentemente introdotte e per la conferma di alcune altre sequenze del main.

Ragione dietro i dati incompleti di sequenza della proteina

Principalmente, 70% della sequenza della proteina ha osservato osservando le elasticità corrispondenti del peptide la riuscita analisi della proteina. Generalmente, 80% della copertura di sequenza della proteina è sufficiente per analizzare il conteggio della proteina in questione nella migrazione da una cella ad un'altra cella. Le ragioni dietro l'analisi che non può identificare tutti gli amminoacidi sono elencate qui sotto:

  • Digestione impropria di proteina.
  • A causa dell'idrofilo o piccolo nei passaggi del peptide della natura attraverso la colonna del retroscena con il sale non può essere analizzato.
  • dovuto frammentazione difficile, peptidi sia idrofobo o troppo grande, non può essere eliminato dalla colonna, o a volte troppo grande per analizzare facendo uso di uno spettrometro di massa.
  • I modi di frammentazione del peptide non possono essere analizzati. Tuttavia, parecchi spettri sono non spiegati nella ricerca.

Impronta digitale di massa del peptide (PMF)

Questa tecnica è usata per l'analisi di proteina non identificata. Secondo il database della sequenza della proteina, la complessità in questione nell'identificazione di una proteina è di meno. Usando la matrice ha assistito lo strumento di dissorbimento/ionizzazione del laser, la massa dei peptidi che non sono spezzettati, dopo la digestione della proteina con una proteinasi specifica o la tripsina, può essere stimata. Poi il programma deve confrontare le misure che sono calcolate dalla proteina digerita rappresentata in un database con un Massachusetts ottenuto del peptide.

Questo metodo è appropriato soltanto per i campioni che contengono una singola proteina, o un paio delle proteine della stessa abbondanza. Se la sequenza delle proteine non è disponibile, quindi questo metodo non può essere usato. Per concludere, questo metodo è stato raccomandato come itinerario per analizzare i campioni dai gel bidimensionali.

Sorgenti:

  1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1665575/
  2. http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1113/jphysiol.2004.080440/full
  3. https://med.virginia.edu/biomolecular-analysis-facility/services/mass-spectrometry/protein-analysis-by-mass-spectrometry/
  4. https://www2.chemistry.msu.edu/faculty/reusch/virttxtjml/spectrpy/massspec/masspec1.htm
  5. http://www.geneontology.org/page/protein-complexes
  6. https://www.researchgate.net/publication/288664230_Protein_complex_analysis_From_raw_protein_lists_to_protein_interaction_networks
  7. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18370112

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Last Updated: Feb 26, 2019

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