Usando a espectrometria em massa para a análise do complexo da proteína

A espectrometria em massa (MS) é considerada ser um método poderoso para rapidamente e eficientemente identificando amostras da proteína. A maioria de edições cruciais na análise do complexo da proteína através do MS incluem a especificidade do complexo e dos contaminadores da proteína na proteína do fundo.

Crédito: ibreakstock/Shutterstock.com

A purificação em tandem da afinidade é o método o mais recomendado para aumentar a especificidade do complexo da proteína. A purificação em tandem da afinidade ajuda em melhorar a relação de relação sinal-ruído pela geração refinada da amostra. Ajudas de rotulagem da proteína isótopa estável em identificar os contaminadores da proteína do fundo e os sócios obrigatórios.

As proteínas combinam geralmente com outros componentes para formar os complexos, estável ou transiente, que são envolvidos em executar actividades biológicas. Além, algumas das proteínas podem interagir particularmente com as partículas da não-proteína, tais como o RNA ou o ADN. Estas interacções são importantes para a função da proteína. Nesta circunstância, o método do MS foi usado para identificar ràpida o componente complexo.

Procedimento para analisar a proteína usando o MS

Hoje, a maioria da análise da seqüência da proteína usa o método do MS. Seguir é as algumas das etapas importantes envolvidas na técnica da análise da proteína:

  • A primeira etapa envolvida na análise da proteína é a purificação, que é executada geralmente pela cromatografia de afinidade. Após a purificação, os componentes do complexo da proteína podem ser separados usando as técnicas que incluem a focagem isoeléctrica, o SDS-PAGE, ou tipos diferentes de método de separação no 2D.

  • As proteínas separadas são vistas então manchando, e para a análise mais aprofundada, pode ser recuperada. Usando o trypsin, as proteínas separadas são digeridas proteolytically criando a combinação dos peptides que podem ser determinados pelo espectrómetro em massa.
  • Não há nenhuma necessidade para a separação do gel, se a amostra tem menos complexidades. Em lugar de, o MS pode directamente ser aplicado ao complexo digerido da proteína. Finalmente, usando ferramentas apropriadas da informática, as proteínas na amostra são figuradas para fora pela recombinação identificada dos peptides.
  • As proteínas são isoladas normalmente em uma coluna reversa da fase usando o inclinação do acetonitrilo. Geralmente, o uso de trifluoroacetic no solvente intercede com a ionização, que pode ser impedida usando o ácido acético. Os Peptides que são ionizados devem ser mantidos no estado do vapor. Isto pode ser conseguido passando o eluído da coluna que contem o solvente assim como os peptides através de uma ponta fina para criar gotas pequenas.
  • Os peptides ionizados são mantidos no estado do vapor, que ocorre após a evaporação solvente. As superfícies cobradas são permitidas transferir o peptide ionizado na Senhora que O MS da cromatografia líquida é uma técnica em que as moléculas são transferidas na Senhora.
  • Collisionally activou a dissociação (CAD) ou a dissociação induzida colisão (CID) é uma aproximação em que os peptides são fragmentados em ligações de peptide colidindo elas com as moléculas do gás. Destes peptides, calcule a massa dos fragmentos. Desde que o MS tem duas etapas, tais como a massa do fragmento do peptide (MSn) e a massa do peptide (MS/MS), existe às vezes lá dois ou mais etapas para a fragmentação.
  • O processo que contem estas duas etapas é sabido como a Senhora em tandem. Para determinar o regime do peptide, os dados em massa do fragmento podem ser utilizados.
  • Geralmente, os dados podem ser analisados usando o computador que compara com as seqüências identificadas. O programa amplamente utilizado é SEQUEST. A análise de dados é feita às vezes manualmente para as seqüências recentemente introduzidas e para a confirmação de algumas outras seqüências do cano principal.

Razão atrás dos dados incompletos da seqüência da proteína

Predominante, 70% da seqüência da proteína observou vendo o peptide correspondente dá a análise bem sucedida da proteína. Geralmente, 80% da cobertura da seqüência da proteína é suficiente para analisar a contagem da proteína envolvida na migração de uma pilha a uma outra pilha. As razões atrás da análise que não pode identificar todos os ácidos aminados estão listadas abaixo:

  • Digestão imprópria da proteína.
  • Devido ao hidrófilo ou pequeno em passagens do peptide da natureza através da coluna da fase traseira com o sal não pode ser analisado.
  • Devido à fragmentação deficiente, peptides seja hidrofóbica ou demasiado grande, não pode ser removido da coluna, ou às vezes demasiado grande para analisar usando um espectrómetro em massa.
  • As maneiras de fragmentação do peptide não podem ser analisadas. Contudo, diversos espectros são inexplicados na investigação.

Fingerprinting em massa do Peptide (PMF)

Esta técnica é usada para a análise de proteína não identificada. Segundo a base de dados da seqüência da proteína, a complexidade envolvida na identificação de uma proteína é menos. Usando a matriz ajudou ao instrumento da dessorção/ionização do laser, massa dos peptides que não são fragmentados, após a digestão da proteína com uma protease específica ou o trypsin, pode ser calculado. Então o programa tem que comparar as medidas que são calculadas da proteína digerida representada em uma base de dados com uma massa obtida do peptide.

Este método é apropriado somente para as amostras que contêm uma única proteína, ou um par de proteínas da mesma abundância. Se a seqüência das proteínas não está disponível, a seguir este método não pode ser usado. Finalmente, este método foi recomendado como uma rota para analisar amostras dos geles bidimensionais.

Fontes:

  1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1665575/
  2. http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1113/jphysiol.2004.080440/full
  3. https://med.virginia.edu/biomolecular-analysis-facility/services/mass-spectrometry/protein-analysis-by-mass-spectrometry/
  4. https://www2.chemistry.msu.edu/faculty/reusch/virttxtjml/spectrpy/massspec/masspec1.htm
  5. http://www.geneontology.org/page/protein-complexes
  6. https://www.researchgate.net/publication/288664230_Protein_complex_analysis_From_raw_protein_lists_to_protein_interaction_networks
  7. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18370112

[Leitura adicional: Espectrometria em massa]

Last Updated: Feb 26, 2019

Comments

The opinions expressed here are the views of the writer and do not necessarily reflect the views and opinions of News-Medical.Net.
Post a new comment
Post