Usando la espectrometría de masa para el análisis del complejo de la proteína

La espectrometría de masa (MS) se considera ser un método potente para de manera rápida y eficiente determinar muestras de la proteína. La mayoría de las entregas cruciales en el análisis del complejo de la proteína a través del ms incluyen la especificidad del complejo y de los contaminantes de la proteína en proteína del fondo.

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La purificación en tándem de la afinidad es el método recomendado para aumentar la especificidad del complejo de la proteína. La purificación en tándem de la afinidad ayuda en perfeccionar el ratio señal/ruido por la generación purificada de la muestra. Ayudas de etiqueta de la proteína isotópica estable en determinar los contaminantes de la proteína del fondo y a los socios obligatorios.

Las proteínas combinan generalmente con otros componentes para formar los complejos, estable o transitorio, que están implicados en la ejecución de actividades biológicas. Además, algunas de las proteínas pueden obrar recíprocamente determinado con las partículas sin proteínas, tales como ARN o DNA. Estas acciones recíprocas son importantes para la función de la proteína. En esta condición, el método del ms se ha utilizado para determinar rápidamente el componente complejo.

Procedimiento para analizar la proteína usando el ms

Hoy, la mayoría del análisis de la serie de la proteína utiliza el método del ms. Los siguientes son los algunos de los pasos importantes implicados en la técnica del análisis de la proteína:

  • El primer paso implicado en análisis de la proteína es la purificación, que es realizada generalmente por cromatografía de afinidad. Después de la purificación, los componentes del complejo de la proteína se pueden separar usando las técnicas que incluyen la concentración isoeléctrica, SDS-PAGE, o diversos tipos de método de separación en 2.os.

  • Entonces las proteínas separadas son vistas manchando, y para el análisis adicional, puede ser recuperado. Usando la tripsina, las proteínas separadas se digieren proteolytically para crear la combinación de los péptidos que se pueden determinar por el espectrómetro de masas.
  • No hay necesidad para la separación del gel, si la muestra tiene menos complejidades. En lugar, el ms puede ser aplicado directamente al complejo digerido de la proteína. Finalmente, usando las herramientas apropiadas de la informática, las proteínas en la muestra son imaginadas por la recombinación determinada de los péptidos.
  • Las proteínas se aíslan normalmente en una olumna reversa de la fase usando gradiente del acetonitrilo. Generalmente, el uso de trifluoracético en el disolvente intercede con la ionización, que se puede prevenir usando el ácido acético. Los péptidos se ionizan que se deben mantener en estado del vapor. Esto puede ser lograda pasando el eluído de la olumna que contiene el disolvente así como los péptidos vía un extremo fino para crear pequeñas gotitas.
  • Los péptidos ionizados se mantienen en el estado del vapor, que ocurre después de la evaporación solvente. Las superficies cargadas se permiten transferir el péptido ionizado en el ms que EL ms de la cromatografía líquida es una técnica en la cual las moléculas se transfieren en ms.
  • Collisionally activó la disociación (CAD) o la disociación inducida colisión (CID) es una aproximación en la cual los péptidos son hechos fragmentos en las ligazones de péptido chocando ellas con las moléculas del gas. De estos péptidos, calcule la masa de fragmentos. Puesto que el ms tiene dos pasos, tales como masa del fragmento del péptido (MSn) y la masa del péptido (MS/MS), a veces allí existe dos o más pasos para la fragmentación.
  • El proceso que contiene estos dos pasos se conoce como ms en tándem. Para determinar las ordenaciones del péptido, los datos en masa del fragmento pueden ser utilizados.
  • Generalmente, los datos se pueden analizar usando la computador que compara con series determinadas. El programa ampliamente utilizado es SEQUEST. El análisis de datos se hace a veces manualmente para las series nuevamente introducidas y para la confirmación de algunas otras series de la cañería maestra.

Razón detrás de los datos incompletos de la serie de la proteína

Predominante, el 70% de la serie de la proteína observaron viendo el péptido correspondiente da el análisis acertado de la proteína. Generalmente, el 80% del abrigo de la serie de la proteína es suficiente analizar la cuenta de la proteína implicada en la migración de una célula a otra célula. Las razones detrás del análisis que no puede determinar todos los aminoácidos son mencionadas abajo:

  • Digestión incorrecta de la proteína.
  • Debido al el hidrofílico o pequeño en pases del péptido de la naturaleza a través de la olumna de las bambalinas con la sal no puede ser analizado.
  • Debido a la fragmentación pobre, péptidos sea hidrofóbico o demasiado grande, no puede ser quitado de olumna, o a veces demasiado grande para analizar usando un espectrómetro de masas.
  • Las maneras de fragmentación del péptido no pueden ser analizadas. Con todo, varios espectros son inexplicados en la investigación.

Huella dactilar en masa del péptido (PMF)

Esta técnica se utiliza para el análisis de la proteína no identificada. Dependiendo de la base de datos de la serie de la proteína, la complejidad implicada en la identificación de una proteína es menos. Usando la matriz ayudada el instrumento de la desorción/de la ionización del laser, masa de los péptidos que no se hacen fragmentos, después de la digestión de la proteína con una proteinasa o una tripsina específica, puede ser estimado. Entonces el programa tiene que comparar las mediciones que se calculan de la proteína digerida representada en una base de datos con un Massachusetts obtenido del péptido.

Este método es apropiado solamente para las muestras que contienen una única proteína, o un par de proteínas de la misma abundancia. Si la serie de las proteínas no está disponible, después este método no puede ser utilizado. Finalmente, este método se ha recomendado como ruta para analizar muestras de los geles bidimensionales.

Fuentes:

  1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1665575/
  2. http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1113/jphysiol.2004.080440/full
  3. https://med.virginia.edu/biomolecular-analysis-facility/services/mass-spectrometry/protein-analysis-by-mass-spectrometry/
  4. https://www2.chemistry.msu.edu/faculty/reusch/virttxtjml/spectrpy/massspec/masspec1.htm
  5. http://www.geneontology.org/page/protein-complexes
  6. https://www.researchgate.net/publication/288664230_Protein_complex_analysis_From_raw_protein_lists_to_protein_interaction_networks
  7. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18370112

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Last Updated: Feb 26, 2019

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