A electroforese do gel é uma técnica amplamente utilizada nos laboratórios de ciência da vida para separar macromoléculas tais como o ADN, o RNA, e as proteínas. Nesta técnica, as moléculas são separadas basearam em seus tamanho e carga elétrica. A electroforese do gel é executada geralmente nos laboratórios para analisar o ADN, o RNA, ou as amostras da proteína das várias fontes.
As amostras do ADN da carga em um Agarose coagulam-se para a electroforese - imagem Copyright: foto da ciência, identificação da imagem: 214331152 através de Shutterstock.com
Princípios de electroforese do gel
A técnica da electroforese do gel explora a diferença em tamanho e a carga de moléculas diferentes em uma amostra. A amostra do ADN ou da proteína a ser separada é carregada sobre a um gel poroso colocado em um media iónico do amortecedor. Na aplicação da carga elétrica, cada molécula que tem o tamanho e a carga diferentes mover-se-á através do gel em velocidades diferentes.
O gel poroso usado nesta técnica actua como uma peneira molecular que separe umas moléculas mais grandes das menores. As moléculas menores movem-se mais rapidamente através do gel quando mais volumosos forem deixados atrás. A mobilidade das partículas é controlada igualmente por sua carga elétrica individual. Dois eléctrodos oposta cobrados que são parte das moléculas da tracção do sistema para delas com base em sua carga.
Como trabalha?
O gel usado na electroforese do gel é feito geralmente de um material chamado o agarose, que é uma substância gelatinosa extraída da alga. Este gel poroso podia ser usado para separar macromoléculas de muitos tamanhos diferentes. O gel é submergido em uma solução de amortecedor de sal em uma câmara da electroforese. O Tris-borato-EDTA (TBE) é de uso geral como o amortecedor. Sua função principal é controlar o pH do sistema. A câmara tem dois eléctrodos - um positivo e um outro negativo - em suas duas extremidades.
As amostras que precisam de ser analisadas são carregadas então em poços minúsculos no gel com a ajuda de uma pipeta. Uma vez que carregar está completo, uma corrente elétrica de 50-150 V é aplicada. Agora, as moléculas cobradas actuais na amostra começam migrar através do gel para os eléctrodos. Negativamente - as moléculas cobradas se movem para o eléctrodo positivo e positivamente - as moléculas cobradas migram para o eléctrodo negativo.
A velocidade em que cada molécula viaja através do gel é chamada sua mobilidade electrophoretic e determinada principalmente por seus carga líquida e tamanho. As moléculas fortemente cobradas movem mais rapidamente do que fraca cobrados. As moléculas menores executam mais rapidamente sair atrás das maiores. Assim, a carga forte e o tamanho pequeno aumentam a mobilidade electrophoretic de uma molécula, quando fracos cobram e o grande tamanho diminui a mobilidade de uma molécula. Quando todas as moléculas em uma amostra são do mesmo tamanho, a separação estará baseada unicamente em seu tamanho.
Uma vez que a separação está completa, o gel está manchado com uma tintura para revelar as faixas da separação. O brometo de Ethidium é uma tintura fluorescente de uso geral na electroforese do gel. O gel é embebido em uma solução diluída do brometo de ethidium e colocado então em um transilluminator UV para visualizar as faixas da separação.
As faixas imediatamente são examinadas ou fotografadas para a referência futura, porque difundirão no gel ao longo do tempo. A tintura pode igualmente ser carregada no poço do gel adiantado para seguir a migração das moléculas enquanto acontece.
Aplicações da electroforese do gel
A electroforese do gel é amplamente utilizada nos laboratórios da biologia molecular e da bioquímica nas áreas tais como a ciência forense, a biologia do conservational, e a medicina.
Algumas aplicações chaves da técnica estão listadas abaixo:
- Na separação de fragmentos do ADN para que o fingerprinting de ADN investigue cenas do crime
- Para analisar resultados da reacção em cadeia da polimerase
- Para analisar os genes associados com uma doença particular
- No ADN que perfila para que os estudos da taxonomia distingam a espécie diferente
- No teste da paternidade usando o fingerprinting de ADN
- No estudo da estrutura e da função das proteínas
- Na análise da resistência antibiótica
- Em técnicas de mancha para a análise das macromoléculas
- No estudo de relacionamentos evolucionários analisando a similaridade genética entre populações ou espécie
Referências
Further Reading