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Quels sont des anticorps de Biotinylated ?

Le biotinylation de condition se rapporte au procédé de gripper la biotine à une protéine ou à un acide nucléique, ou dans certains cas à un autre type de molécule.

Anticorps

Crédit d'image : Utas7777777/Shutterstock.com

Un anticorps est l'un de ces objectifs potentiels, une protéine du sang qui répond à la présence des antigènes spécifiques qui peuvent être employés comme sondent dans la recherche de cellules. En bref, un anticorps biotinylated est l'une de ces protéines du sang avec de la biotine fixée à lui.

Il y a deux méthodes principales de biotinylation d'anticorps, de méthode complexe (ABC) d'avidine-biotine, et de méthode marquée (LSAB) de streptavidin-biotine, qui sont discutées en détail.

Comment des anticorps biotinylated sont produits

La biotine est une substance trouvée naturellement dans différents types d'aliments, tels que des oeufs, des produits laitiers, des saumons, le foie, et beaucoup plus. Également connu comme ₇ de la vitamine H ou de la vitamine B, la biotine est essentielle à on des procédés biologiques de clavette au sein du corps humain, en grande partie des procédés métaboliques liés à l'utilisation des acides aminés, des hydrates de carbone, et des graisses.

Le procédé du biotinylation est rapide, et parce que la molécule est relativement petite, sa pièce d'assemblage à un anticorps n'est pas pensée pour influencer de manière significative son fonctionnement normal. Il n'y a pas un seul protocole reçu unique pour le biotinylation des anticorps.

Cependant, la base du modèle se fonde sur l'interaction intense entre la biotine et l'avidine ou le streptavidin, qui sont considérés certaines des interactions non-covalentes les plus intenses entre une protéine et un ligand.

Ces interactions sont également immunisées contre les pressions des extrémités de pH et de température, ainsi que des concentrations élevées et des dénaturants en sel, rendant l'interaction de biotin-avidin/streptavidin incroyablement utile pour viser des protéines d'intérêt.

Une méthode normale de biotinylation d'anticorps concerne utilisant des esters de N-Hydroxysulfosuccinimide (NHS) de biotine comme réactif de biotinylation. Les NHS sont le type le plus populaire de réactif utilisé, bien qu'il soit possible de compléter le procédé de biotinylation avec d'autres genres de réactifs.

Des NHS (ou un substitut) sont employés pour activer la biotine, que l'amide stable de formes colle avec les groupes acides aminés primaires dans un tampon alcaline. La chaîne latérale des résidus de la lysine (k) et les N-terminus de chaque polypeptide sont des amines primaires qui agissent en tant qu'objectifs de marquage courants sur l'anticorps.

Avidine contre des méthodes de streptavidin

La méthode fondamentale de biotinylation d'anticorps peut être coupée en deux techniques indépendantes concernant si des interactions d'avidine ou de streptavidin sont utilisées. Si l'avidine est employée, la méthode complexe (ABC) d'avidine-biotine est appropriée.

C'est où des composés d'avidine-biotine branchés par des enzymes de journaliste sont incubés avec des anticorps biotinylated. L'anticorps primaire est d'abord incubé avec l'échantillon pour tenir compte de gripper avec de l'antigène d'objectif.

Après ceci, un anticorps secondaire biotinylated est incubé avec le tissu, entraînant gripper à l'anticorps primaire. Une enzyme biotinylated est alors príncubée avec de l'avidine libre, ayant pour résultat des composés d'avidine-biotine-enzyme.

Une partie de ce mélange est alors ajoutée à l'échantillon, où les autres sites biotine-grippants sur l'avidine grippent à l'anticorps biotinylated qui est déjà fixé au prélèvement de tissu. La sensibilité de cette méthode peut être augmentée en augmentant le nombre de molécules d'enzymes qui grippent à l'antigène, qui peut être réalisé en augmentant l'activité enzymatique localisée par l'intensité de journaliste.

La deuxième méthode, la méthode marquée (LSAB) de streptavidin-biotine, concerne l'amplification du signe en incubant les composés biotinylated d'anticorps/streptavidin avec des enzymes de journaliste. Les composés produits dans la méthode de LSAB sont plus petits que la méthode décrite ci-dessus d'ABC. Dans cette méthode, des conjugués de streptavidin-enzyme sont utilisés pour le dépistage des anticorps primaires biotinylated par limite sur des prélèvements de tissu. Dans la plupart des cas, la méthode d'ABC sera la première étude à moins que les composés d'avidine-biotine-enzyme deviennent trop grands et peut plus ne réussir par le tissu.

Le LSAB souillant la méthode produit de plus petits composés qui peuvent facilement infiltrer le tissu, ayant le choc d'améliorer la sensibilité par jusqu'à huit fois qui de la méthode d'ABC. Des solutions de rechange à l'avidine peuvent être employées dans cette méthode, qui peut avoir l'effet de réduire le bruit de fond et promouvoir la sensibilité croissante.

La méthode de LSAB concerne deux scènes principales. D'abord, les anticorps primaires sont incubés à côté des anticorps secondaires biotinylated, avec le prélèvement de tissu utilisant le même procédé donné dans la méthode d'ABC. Après ceci, le streptavidin enzyme-conjugué est ajouté et incubé, ayant pour résultat les sites biotine-grippants sur la protéine enzyme-conjuguée devenant occupée.

Fonctionnements et limitations des anticorps biotinylated

Des anticorps de Biotinylated sont employés pour le dépistage des protéines d'inférieur-abondance. Le procédé du biotine-marquage est également fréquemment employé comme méthode de marquage non-radiative de protéines, et comme technique de purification de protéine.

Tandis qu'il y a beaucoup d'avantages à cette méthode, telle que son état non radioactif, qui a mené à son adoption large, il a également une limitation notable.

Car la biotine est employée par le fuselage pour beaucoup de procédés, il est naturel que la biotine endogène en tissus puisse être présente, ayant l'effet d'augmenter le signe de mouvement propre. Pour cette raison, des mesures de bloquer la biotine endogène sont exigées en vérifiant des tissus avec des expressions élevées de biotine, de ce type du foie ou du rein.

Sources :

Bratthauer, G. (2009). La méthode complexe (ABC) d'Avidine-Biotine et d'autres méthodes obligatoires d'Avidine-Biotine. Méthodes d'immunocytochimique et protocoles, pp.257-270. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20012837

Mao, S. (2009). Biotinylation des anticorps. Méthodes d'immunocytochimique et protocoles, pp.49-52. https://link.springer.com/protocol/10.1007%2F978-1-59745-324-0_7

Strachan, E., Mallia, A., Cox, J., Antharavally, B., Desai, S., Sykaluk, L., O'Sullivan, V. et Bell, P. (2004). Biotinylation en phase solide des anticorps. Tourillon de la reconnaissance moléculaire, 17(3), pp.268-276. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15137036

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Last Updated: Jan 30, 2020

Sarah Moore

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