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Che cosa sono anticorpi di Biotinylated?

Il biotinylation di termine si riferisce al trattamento di legare la biotina ad una proteina o ad un acido nucleico, o in alcuni casi ad un altro tipo di molecola.

Anticorpo

Credito di immagine: Utas7777777/Shutterstock.com

Un anticorpo è uno di questi obiettivi potenziali, una proteina del sangue che risponde alla presenza di antigeni specifici che possono essere utilizzati come sondano nella ricerca delle cellule. In breve, un anticorpo biotinylated è una di queste proteine del sangue con biotina fissata a.

Ci sono due metodi main di biotinylation dell'anticorpo, del metodo complesso (ABC) della avidina-biotina e del metodo contrassegnato (LSAB) della streptavidin-biotina, di cui tutt'e due sono discussi dettagliatamente.

Come gli anticorpi biotinylated sono creati

La biotina è una sostanza trovata naturalmente nei tipi differenti dell'alimento, come le uova, i prodotti lattier-caseario, il salmone, il fegato e molto. Inoltre conosciuto come ₇ della vitamina H o della vitamina B, la biotina è essenziale a molti trattamenti biologici di tasto all'interno del corpo umano, principalmente trattamenti metabolici relativi all'utilizzazione degli amminoacidi, carboidrati e grassi.

Il trattamento del biotinylation è veloce e perché la molecola è relativamente piccola, il suo collegamento ad un anticorpo non è pensato per urtare significativamente il suo funzionamento normale. C'è nessuno singolo protocollo accettato per il biotinylation degli anticorpi.

Tuttavia, la base del modello conta sulla forte interazione fra biotina ed avidina o streptavidin, che sono considerati come alcune di più forti interazioni non covalenti fra una proteina e un legante.

Queste interazioni sono egualmente immuni alle pressioni di pH e temperature estreme come pure alte concentrazioni e denaturanti nel sale, rendenti l'interazione di biotin-avidin/streptavidin incredibilmente utile per l'ottimizzazione delle proteine di interesse.

Un metodo standard di biotinylation dell'anticorpo comprende facendo uso degli esteri di N-Hydroxysulfosuccinimide (NHS) di biotina come il reagente di biotinylation. NHS è il tipo più popolare di reagente usato, sebbene sia possibile realizzare il trattamento di biotinylation con altri generi di reagenti.

NHS (o un sostituto) è usato per attivare la biotina, che l'ammide stabile dei moduli salda con i gruppi primari dell'amminoacido all'interno di un buffer alcalino. La catena laterale dei residui della lisina (k) e l'N-estremità di ogni polipeptide sono ammine primarie che fungono da obiettivi di contrassegno comuni sull'anticorpo.

Avidina contro i metodi dello streptavidin

Il metodo di base di biotinylation dell'anticorpo può essere diviso in due tecniche separate per quanto riguarda se le interazioni dello streptavidin o dell'avidina sono utilizzate. Se l'avidina è usata, il metodo complesso (ABC) della avidina-biotina è appropriato.

Ciò è dove i complessi della avidina-biotina connessi attraverso gli enzimi del reporter sono incubati con gli anticorpi biotinylated. L'anticorpo primario in primo luogo è incubato con il campione per tenere conto legare con l'antigene dell'obiettivo.

A seguito di questo, un anticorpo secondario biotinylated è incubato con il tessuto, causante legare all'anticorpo primario. Un enzima biotinylated poi è preincubato con avidina libera, con conseguente complessi dell'avidina-biotina-enzima.

Una parte di questa miscela poi si aggiunge al campione, in cui i siti restanti dell'biotina-associazione sull'avidina legano all'anticorpo biotinylated che già è fissato al campione di tessuto. La sensibilità di questo metodo può essere sollevata aumentando il numero delle molecole degli enzimi che legano all'antigene, che può essere raggiunto through aumentando l'attività dell'enzima localizzata con l'intensità del reporter.

Il secondo metodo, il metodo contrassegnato (LSAB) della streptavidin-biotina, comprende l'amplificazione del segnale through incubando i complessi biotinylated streptavidin/dell'anticorpo con gli enzimi del reporter. I complessi creati nel metodo di LSAB sono più piccoli del metodo sopra descritto di ABC. In questo metodo, i coniugati dell'streptavidin-enzima sono utilizzati per la rilevazione degli anticorpi primari biotinylated limite sui campioni di tessuto. Nella maggior parte dei casi, il metodo di ABC sarà la prima considerazione a meno che i complessi dell'avidina-biotina-enzima diventino troppo grandi e può più non passare attraverso il tessuto.

Il LSAB che macchia il metodo genera i più piccoli complessi che possono infiltrarsi facilmente nel tessuto, aventi l'impatto del miglioramento della sensibilità entro fino a otto volte che del metodo di ABC. Le alternative ad avidina possono essere utilizzate in questo metodo, che può avere l'effetto di diminuzione del rumore di fondo ed avanzare la sensibilità aumentante.

Il metodo di LSAB comprende due fasi principali. In primo luogo, gli anticorpi primari sono incubati accanto agli anticorpi secondari biotinylated, con il campione di tessuto facendo uso dello stesso trattamento descritto nel metodo di ABC. A seguito di questo, lo streptavidin enzima-coniugato si aggiunge ed incubato, con conseguente siti dell'biotina-associazione sulla proteina enzima-coniugata che è occupata.

Funzioni e limitazioni degli anticorpi biotinylated

Gli anticorpi di Biotinylated sono usati per la rilevazione delle proteine dell'basso abbondanza. Il trattamento di biotina-contrassegno egualmente è usato frequentemente come metodo di contrassegno non radiattivo di proteine e come tecnica di depurazione della proteina.

Mentre ci sono molti vantaggi a questo metodo, quale il suo stato non radioattivo, che piombo alla sua ampia approvazione, egualmente presenta una limitazione notevole.

Poichè la biotina è usata dall'ente per molti trattamenti, è naturale che la biotina endogena in tessuti può essere presente, avendo l'effetto di aumento del segnale di sfondo. A causa di questo, le misure per bloccare la biotina endogena sono richieste quando studia i tessuti con le alte espressioni della biotina, come quelle dal fegato o dal rene.

Sorgenti:

Bratthauer, G. (2009). Il metodo complesso (ABC) della Avidina-Biotina ed altri metodi obbligatori della Avidina-Biotina. Metodi e protocolli Immunocytochemical, pp.257-270. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20012837

Mao, S. (2009). Biotinylation degli anticorpi. Metodi e protocolli Immunocytochemical, pp.49-52. https://link.springer.com/protocol/10.1007%2F978-1-59745-324-0_7

Strachan, E., Mallia, A., Cox, J., Antharavally, B., Desai, S., Sykaluk, L., O'Sullivan, V. e Bell, P. (2004). Biotinylation in fase solida degli anticorpi. Giornale di riconoscimento molecolare, 17(3), pp.268-276. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15137036

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Last Updated: Jan 30, 2020

Sarah Moore

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