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Que são anticorpos de Biotinylated?

O biotinylation do termo refere o processo de ligar a biotina a uma proteína ou a um ácido nucleico, ou em alguns casos a um outro tipo de molécula.

Anticorpo

Crédito de imagem: Utas7777777/Shutterstock.com

Um anticorpo é um destes alvos potenciais, uma proteína de sangue que responda à presença de antígenos específicos que podem ser usados como sondam na pesquisa da pilha. Em curto, um anticorpo biotinylated é uma destas proteínas de sangue com a biotina anexada a ele.

Há dois métodos principais do biotinylation do anticorpo, do método complexo (ABC) da avidin-biotina, e do método etiquetado (LSAB) da streptavidin-biotina, ambo são discutidos em detalhe.

Como os anticorpos biotinylated são criados

A biotina é uma substância encontrada naturalmente em tipos diferentes do alimento, tais como ovos, produtos lácteos, salmões, fígado, e muito mais. Igualmente sabido como o ₇ da vitamina H ou da vitamina B, a biotina é essencial a muitos processos biológicos da chave dentro do corpo humano, na maior parte os processos metabólicos relativos à utilização dos ácidos aminados, os hidratos de carbono, e as gorduras.

O processo de biotinylation é rápido, e porque a molécula é relativamente pequena, seu acessório a um anticorpo não é pensado para impactar significativamente seu funcionamento normal. Há ninguém único protocolo aceitado para o biotinylation dos anticorpos.

Contudo, a base do modelo confia na interacção forte entre a biotina e o avidin ou o streptavidin, que são considerados ser algumas das interacções não-covalent as mais fortes entre uma proteína e uma ligante.

Estas interacções são igualmente imunes às pressões de extremos do pH e da temperatura, assim como concentrações altas e desnaturalizadores de sal, fazendo a interacção de biotin-avidin/streptavidin incredibly útil para visar proteínas do interesse.

Um método padrão do biotinylation do anticorpo envolve usar ésteres de N-Hydroxysulfosuccinimide (NHS) da biotina como o reagente do biotinylation. O NHS é o tipo o mais popular de reagente usado, embora seja possível terminar o processo do biotinylation com outros tipos dos reagentes.

O NHS (ou um substituto) são usados para activar a biotina, que o amido estável dos formulários liga com grupos preliminares do ácido aminado dentro de um amortecedor alcalino. O sidechain da lisina (K) os resíduos e o N-término de cada polipeptídeo são as aminas preliminares que actuam como alvos de rotulagem comuns no anticorpo.

Avidin contra métodos do streptavidin

O método básico do biotinylation do anticorpo pode ser separação em duas técnicas separadas em relação a se as interacções do avidin ou do streptavidin estão utilizadas. Se o avidin é usado, o método complexo (ABC) da avidin-biotina é apropriado.

Isto é o lugar onde os complexos da avidin-biotina conectados através das enzimas do repórter são incubados com anticorpos biotinylated. O anticorpo preliminar é incubado primeiramente com a amostra para permitir ligar com o antígeno do alvo.

Depois disto, um anticorpo secundário biotinylated é incubado junto com o tecido, causando a ligação ao anticorpo preliminar. Uma enzima biotinylated pre-é incubada então com avidin livre, tendo por resultado complexos da avidin-biotina-enzima.

Uma parcela desta mistura é adicionada então à amostra, onde os locais biotina-obrigatórios permanecendo no avidin ligam ao anticorpo biotinylated que é anexado já à amostra de tecido. A sensibilidade deste método pode ser levantada aumentando o número de moléculas da enzima que ligam ao antígeno, que pode ser conseguido com do aumento da actividade de enzima localizada com a intensidade do repórter.

O segundo método, o método etiquetado (LSAB) da streptavidin-biotina, envolve a amplificação do sinal com da incubação dos complexos biotinylated do anticorpo/streptavidin junto com enzimas do repórter. Os complexos criados no método de LSAB são menores do que o método descrito acima de ABC. Neste método, os conjugado da streptavidin-enzima são utilizados para a detecção de anticorpos preliminares biotinylated limite em amostras de tecido. Na maioria dos casos, o método de ABC será a primeira consideração a menos que os complexos da avidin-biotina-enzima se tornarem demasiado grandes e pode já não passar através do tecido.

O LSAB que mancha o método gera os complexos menores que podem facilmente infiltrar o tecido, tendo o impacto de melhorar a sensibilidade em até oito vezes que do método de ABC. As alternativas ao avidin podem ser usadas neste método, que pode ter o efeito de reduzir o ruído de fundo e promover a sensibilidade crescente.

O método de LSAB envolve dois palcos principais. Primeiramente, os anticorpos preliminares são incubados ao lado dos anticorpos secundários biotinylated, com a amostra de tecido usando o mesmo processo esboçado no método de ABC. Depois disto, o streptavidin enzima-conjugado é adicionado e incubado, tendo por resultado os locais biotina-obrigatórios na proteína enzima-conjugada que torna-se ocupada.

Funções e limitações de anticorpos biotinylated

Os anticorpos de Biotinylated são usados para a detecção de proteínas da baixo-abundância. O processo de biotina-rotulagem é usado igualmente freqüentemente como um método de rotulagem não-radiative das proteínas, e como uma técnica da purificação da proteína.

Quando houver muitos benefícios a este método, tal como seu estado não-radioactivo, que conduziu a sua adopção larga, igualmente tem uma limitação notável.

Porque a biotina é usada pelo corpo para muitos processos, é natural que a biotina endógena nos tecidos pode esta presente, tendo o efeito de aumentar o sinal de fundo. Devido a isto, as medidas obstruir a biotina endógena são exigidas ao investigar tecidos com expressões altas da biotina, tais como aquelas do fígado ou do rim.

Fontes:

Bratthauer, G. (2009). O método complexo (ABC) da Avidin-Biotina e outros métodos obrigatórios da Avidin-Biotina. Métodos e protocolos Immunocytochemical, pp.257-270. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20012837

Mao, S. (2009). Biotinylation dos anticorpos. Métodos e protocolos Immunocytochemical, pp.49-52. https://link.springer.com/protocol/10.1007%2F978-1-59745-324-0_7

Strachan, E., Mallia, A., Cox, J., Antharavally, B., Desai, S., Sykaluk, L., O'Sullivan, V. e Bell, P. (2004). biotinylation da Contínuo-fase dos anticorpos. Jornal do reconhecimento molecular, 17(3), pp.268-276. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15137036

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Last Updated: Jan 30, 2020

Sarah Moore

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Sarah Moore

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