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¿Cuáles son anticuerpos de Biotinylated?

El biotinylation del término refiere al proceso de atar la biotina a una proteína o a un ácido nucléico, o en algunos casos a otro tipo de molécula.

Anticuerpo

Haber de imagen: Utas7777777/Shutterstock.com

Un anticuerpo es uno de estos objetivos potenciales, una proteína de sangre que responda a la presencia de antígenos específicos que se puedan utilizar como sonden en la investigación de la célula. En fin, un anticuerpo biotinylated es una de estas proteínas de sangre con la biotina sujetada a él.

Hay dos métodos principales de biotinylation del anticuerpo, del método complejo (ABC) de la avidina-biotina, y del método etiqueta (LSAB) de la streptavidin-biotina, que se discuten detalladamente.

Cómo se crean los anticuerpos biotinylated

La biotina es una substancia encontrada naturalmente en diversos tipos de la comida, tales como huevos, productos lácteos, salmones, hígado, y mucho más. También conocido como ₇ de la vitamina H o de la vitamina B, la biotina es esencial para muchos los procesos biológicos de la llave dentro del cuerpo humano, sobre todo los procesos metabólicos relacionados con la utilización de aminoácidos, los hidratos de carbono, y las grasas.

El proceso del biotinylation es rápido, y porque la molécula es relativamente pequeña, su agregación a un anticuerpo no se piensa para afectar importante su funcionamiento normal. Hay nadie único protocolo validado para el biotinylation de anticuerpos.

Sin embargo, la base del modelo confía en la acción recíproca fuerte entre la biotina y la avidina o el streptavidin, que se consideran ser algunas de las acciones recíprocas no-covalentes más fuertes entre una proteína y un ligand.

Estas acciones recíprocas son también inmunes a las presiones de los extremos del pH y de la temperatura, así como las altas concentraciones y los desnaturalizadores de la sal, haciendo la acción recíproca de biotin-avidin/streptavidin increíblemente útil para apuntar las proteínas del interés.

Un método estándar de biotinylation del anticuerpo implica usando los ésteres de N-Hydroxysulfosuccinimide (NHS) de la biotina como el reactivo del biotinylation. NHS es el tipo más popular de reactivo usado, aunque sea posible terminar el proceso del biotinylation con otras clases de reactivos.

NHS (o un reemplazo) se utiliza para activar la biotina, que la amida estable de las formas pega con los grupos primarios del aminoácido dentro de un almacenador intermedio alcalino. La cadena lateral de los residuos de la lisina (k) y el N-término de cada polipéptido son las aminas primarias que actúan como objetivos de etiqueta comunes en el anticuerpo.

Avidina comparado con métodos del streptavidin

El método básico de biotinylation del anticuerpo se puede partir en dos técnicas separadas en lo que concierne si las acciones recíprocas de la avidina o del streptavidin están utilizadas. Si se utiliza la avidina, el método complejo (ABC) de la avidina-biotina es apropiado.

Aquí es donde los complejos de la avidina-biotina conectados a través de las enzimas del reportero se incuban con los anticuerpos biotinylated. El anticuerpo primario primero se incuba con la muestra para permitir atar con el antígeno del objetivo.

Después de esto, un anticuerpo secundario biotinylated se incuba junto con el tejido, causando atar al anticuerpo primario. Una enzima biotinylated entonces se preincuba con avidina libre, dando por resultado complejos de la avidina-biotina-enzima.

Una porción de esta mezcla entonces se agrega a la muestra, donde los sitios biotina-obligatorios restantes en la avidina atan al anticuerpo biotinylated que se sujeta ya a la muestra de tejido. La sensibilidad de este método puede ser aumentada aumentando el número de moléculas de la enzima que aten al antígeno, que se puede lograr con el aumento de actividad enzimática localizada con intensidad del reportero.

El segundo método, el método etiqueta (LSAB) de la streptavidin-biotina, implica la amplificación de la señal con la incubación de los complejos biotinylated del anticuerpo/del streptavidin junto con las enzimas del reportero. Los complejos creados en el método de LSAB son más pequeños que el método descrito antes de ABC. En este método, las conjugaciones de la streptavidin-enzima se utilizan para la detección de anticuerpos primarios biotinylated salto en muestras de tejido. En la mayoría de los casos, el método de ABC será la primera consideración a menos que los complejos de la avidina-biotina-enzima lleguen a ser demasiado grandes y puede pasar no más a través del tejido.

El LSAB que mancha método genera complejos más pequeños que puedan infiltrar fácilmente el tejido, teniendo el impacto de perfeccionar sensibilidad por hasta ocho veces que del método de ABC. Las opciones a la avidina se pueden utilizar en este método, que puede tener el efecto de reducir ruido de fondo y fomentar sensibilidad cada vez mayor.

El método de LSAB implica dos escenarios principales. Primero, los anticuerpos primarios se incuban junto a los anticuerpos secundarios biotinylated, con la muestra de tejido usando el mismo proceso contorneado en el método de ABC. Después de esto, el streptavidin enzima-conjugado se agrega y se incuba, dando por resultado los sitios biotina-obligatorios en la proteína enzima-conjugada de ocupación.

Funciones y limitaciones de anticuerpos biotinylated

Los anticuerpos de Biotinylated se utilizan para la detección de las proteínas de la inferior-abundancia. El proceso de la biotina-etiqueta también se utiliza con frecuencia como método de etiqueta no-radiativo de proteínas, y como técnica de la purificación de la proteína.

Mientras que hay muchas ventajas a este método, tal como su estado no radiactivo, que ha llevado a su adopción amplia, también tiene una limitación notable.

Pues la biotina es utilizada por la carrocería para muchos procesos, es natural que la biotina endógena en tejidos puede estar presente, teniendo el efecto de aumentar la señal de fondo. Debido a esto, se requieren las dimensiones de cegar la biotina endógena al investigar tejidos con altas expresiones de la biotina, tales como ésos del hígado o del riñón.

Fuentes:

Bratthauer, G. (2009). El método complejo (ABC) de la Avidina-Biotina y otros métodos obligatorios de la Avidina-Biotina. Métodos y protocolos Immunocytochemical, pp.257-270. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20012837

Mao, S. (2009). Biotinylation de anticuerpos. Métodos y protocolos Immunocytochemical, pp.49-52. https://link.springer.com/protocol/10.1007%2F978-1-59745-324-0_7

Strachan, E., Mallia, A., $cox, J., Antharavally, B., Desai, S., Sykaluk, L., O'Sullivan, V. y Bell, P. (2004). biotinylation de la Sólido-fase de anticuerpos. Gorrón del reconocimiento molecular, 17(3), pp.268-276. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15137036

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Last Updated: Jan 30, 2020

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