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Quels sont des contrôles de charge ?

Le boulonnage occidental est une méthode bien établie qui est actuel comptée en circuit dans des laboratoires de biologie pour déterminer les protéines spécifiques et leur abondance dans un échantillon donné de cellules ou de tissu.

Tache occidentale

Crédit d'image : SINITAR/Shutterstock.com

Les contrôles de charge sont une part essentielle du procédé occidental de tache, et ils sont nécessaires pour que les évaluations précises soient effectuées.

Le contrôle de charge est une protéine, habituellement une qui expression constitutive de haut niveau de documents dans le type témoin ou de cellules à l'étude. Les protéines telles que la bêta-actine ou le GADPH sont ceux avec les expressions élevées et omniprésentes qui sont utilisées généralement comme contrôles de charge.

Ces protéines sont employées pour indiquer la charge égale des échantillons en travers de tous les puits. Elles expriment également le transfert correcte des protéines sur la membrane pendant le procédé épongeant occidental.

De façon générale, ces protéines sont une condition de pouvoir déterminer exactement l'expression de la protéine dans le Western blotting et afficher avec précision des résultats.

Pourquoi les contrôles de charge sont-ils nécessaires pour le Western blotting ?

Les contrôles de charge atteignent de nombreux objectifs dans une enquête occidentale de tache. Ils sont essentiellement employés pour normaliser les niveaux de la protéine trouvés dans un échantillon en s'assurant que la charge de protéine est la même en travers du gel. Ci-après, les quatre raisons principales pourquoi les contrôles de charge sont essentiels sont données.

Premièrement, les contrôles de charge fournissent une méthode de quantification, permettant à des chercheurs de prévoir la protéine s'élève dans chaque voie quand ils n'ont pas été chargés régulièrement. Pour faire ceci, la densité de la bande de contrôle de charge est employée pour rectifier pour les différences dans la charge.

Un transfert égal est la deuxième demande des contrôles de charge dans les taches occidentales. Il est indispensable que quand des comparaisons sont effectuées entre l'expression de la protéine de différents échantillons, chaque échantillon ait eu même un transfert à partir du gel à la membrane en travers du gel entier. Des contrôles de charge sont employés pour vérifier ces transferts.

L'évaluation de la tache occidentale donne droit des faces un défi particulier quand un grand nombre de voies sont faites fonctionner simultanément. Puisque les protéines dans les voies extérieures du gel obtiennent transférées dans les membranes positionnées près du bâti, ceci peut avoir comme conséquence l'effet d'arête, où il y a plus de variation de gripper aux arêtes par rapport au reste du gel. Les contrôles de charge peuvent signifier si ceci s'est produit et peut permettre à des chercheurs de rectifier pour lui.

En conclusion, la plupart des projets de recherche recherchent à être publiés en tourillons illustres. Ces tourillons exigent de la recherche de répondre à certains critères, de ce type que les chercheurs doivent fournir la preuve irréfutable pour leurs conclusions. Les contrôles compris dans des méthodologies de recherches aident le présent un point de droit pour la preuve irréfutable.

Avantages des contrôles de charge

Ne pas comprendre des contrôles de charge en effectuant des techniques occidentales de tache peut aboutir à rechercher ne pas être publié parce qu'on ne le vérifie pas. Par conséquent, un avantage de comprendre des contrôles de charge est que la recherche répond aux critères pour être publiée.

En outre, les contrôles de charge ajoutent au niveau de la qualité des caractéristiques rassemblées en tant que lui peuvent être avantageux en rectifiant pour des erreurs et en assurant l'exactitude d'information employée pour effectuer des conclusions indispensables. Résultats peu concluants ou incorrects de limite de contrôles de charge, et pour cette raison projets de recherche de sauvegarde temps et argent en réexécutant des procédures.

De façon générale, les contrôles de charge améliorent la fiabilité et l'efficacité de la méthode occidentale de tache et permettent à des études au moyen de elles de répondre aux critères pour être publiés.

Types de contrôles de charge

Actuel, de nombreuses protéines sont employées comme contrôles de charge. Le type de protéine choisi pour l'usage dans une étude dépendra souvent de ce qui est vérifié et de ce qui est recherché pour être découvert de l'échantillon. Les contrôles les plus populaires sont :

Actine

l'Entier-cellule et les applications cytoplasmiques d'extrait sont parfaites pour l'usage d'actine. Cependant, parce que c'est une composante d'action de muscle, il ne peut pas être employé dans des échantillons de muscle squelettique. L'actine existe sous beaucoup de formes, le rendant incroyablement polyvalent.

Bêta-Actine (42 kDa)

Une forme populaire d'actine est Bêta-Actine (42 kDa). Elle peut être employée dans les échantillons de tous les types de cellule eucaryote, qui est pourquoi c'est un choix populaire d'échantillon de charge. Supplémentaire, ses niveaux d'expression ne varient pas de manière significative en raison de la demande de règlement cellulaire, lui effectuant de nouveau un contrôle largement adapté.

GAPDH

Le phosphate-déshydrogénase de la glycéraldéhyde 3, connu sous le nom de GAPDH, est une entier-cellule et un contrôle de charge cytoplasmique d'extrait. Il agit également en tant que catalyseur pour la perte de molécules de glucose et de carbone. Son niveau d'expression varie entre les tissus, qui est un facteur important à considérer quand vu lui comme contrôle de charge.

Porin

Porin est le plus utilisé généralement dans les échantillons de protéines mitochondriales. C'est une protéine anion-sélectrice tension-dépendante de glissière qui est une composante de nombreux types de tissu.

B1 de Lamin

Le B1 de Lamin est considéré comme jouer un rôle dans la stabilité nucléaire dans une cellule. Il convient comme contrôle de charge pour les enveloppes nucléaires de protéine, mais il devrait seulement être employé si l'enveloppe nucléaire est procurable.

TBP

La protéine Tata-grippante, connue sous le nom de TBP, est une protéine obligatoire de transcription qui fonctionne avec de la polymérase ARN II. C'est un autre contrôle de charge courant pour les protéines nucléaires.

Résumé

Pour mesurer exactement l'expression de la protéine et afficher des résultats occidentaux de tache, l'utilisation des contrôles de charge il est essentielle. Ces protéines sont employées pour augmenter la fiabilité et l'efficacité générales de la méthode occidentale de tache et permettent à des études de répondre aux critères pour la publication. Tandis que les nombreux contrôles de charge existent, une partie du plus courant comprend l'actine (en particulier la forme de Bêta-Actine), le GAPDH, le Porin, le B1 de Lamin et le TBP.

Sources :

  Eaton, S., Roche, S., Llavero Hurtado, M., Oldknow, K., Farquharson, C., Gillingwater, T. et Wishart, T. (2013). Analyse de protéine totale comme contrôle de charge fiable pour le Western blotting fluorescent quantitatif. PLoS UN, 8(8), p.e72457. https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0072457

  Ghosh, R., Gilda, J. et Gomes, A. (2014). La nécessité de et les stratégies pour améliorer la confiance dans l'exactitude des taches occidentales. Examen expert de la protéomique, 11(5), pp.549-560. https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1586/14789450.2014.939635

  Murphy, R. et agneau, G. (2013). Considérations importantes pour des analyses de protéine utilisant des techniques basées sur anticorps : résultats de -tailles de Western blotting de réduction de taille. Le tourillon de la physiologie, 591(23), pp.5823-5831. https://physoc.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1113/jphysiol.2013.263251

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Last Updated: Feb 7, 2020

Sarah Moore

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Sarah Moore

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