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Che cosa sono comandi di caricamento?

La bullonatura occidentale è un metodo affermato che corrente è contato sopra nei laboratori di biologia per la determinazione le proteine specifiche e della loro abbondanza all'interno di un campione dato delle celle o del tessuto.

Macchia occidentale

Credito di immagine: SINITAR/Shutterstock.com

I comandi di caricamento sono una parte essenziale del trattamento occidentale della macchia e sono necessari affinchè le interpretazioni accurate siano fatti.

Il controllo di caricamento è una proteina, solitamente una che esibisce l'espressione costitutiva ad alto livello all'interno del tipo delle cellule o del campione in esame. Le proteine quali beta-actina o GADPH sono quelle con le alte ed espressioni onnipresente che sono comunemente usate come comandi di caricamento.

Queste proteine sono usate per indicare il caricamento uguale dei campioni attraverso tutti i pozzi. Egualmente esprimono il trasferimento adeguato delle proteine sulla membrana durante il trattamento macchiante occidentale.

In generale, queste proteine sono un requisito potere determinare esattamente l'espressione della proteina nel macchiare occidentale e leggere precisamente i risultati.

Perché i comandi di caricamento necessari per occidentale stanno macchiando?

I comandi di caricamento hanno i numerosi scopi in una ricerca occidentale della macchia. Essenzialmente sono usati per normalizzare i livelli di proteina individuati all'interno di un campione assicurandosi che il caricamento della proteina sia lo stesso attraverso il gel. Sotto, i quattro motivi principali perché i comandi di caricamento sono cruciali sono descritti.

In primo luogo, i comandi di caricamento forniscono un metodo di quantificazione, permettendo ai ricercatori di calcolare la proteina ammontano in ogni corsia quando non sono stati caricati neppure. Per fare questa, la densità della banda di controllo di caricamento è usata per correggere le differenze nel caricamento.

Un trasferimento uguale è la seconda applicazione dei comandi di caricamento nelle macchie occidentali. È vitale che quando i confronti sono fatti fra l'espressione della proteina dei campioni differenti, ogni campione ha avuto anche un trasferimento dal gel nella membrana attraverso l'intero gel. I comandi di caricamento sono usati per controllare questi trasferimenti.

L'interpretazione della macchia occidentale risulta fronti di taglio una sfida particolare quando tantissime corsie stanno funzionande simultaneamente. Poiché le proteine all'interno delle corsie esterne del gel ottengono trasferite nelle membrane posizionate vicino al fotogramma, questa può provocare l'effetto marginale, dove c'è la più variazione in associazione alle barriere rispetto al resto del gel. I comandi di caricamento possono significare se questo ha accaduto e che può permettere che i ricercatori la correggano.

Per concludere, la maggior parte dei progetti di ricerca cercano di essere pubblicati in pubblicazioni rinomate. Queste pubblicazioni richiedono la ricerca di rispondere a determinati criteri, come che quella i ricercatori devono fornire la prova ben fondata per le loro conclusioni. I comandi inclusi all'interno delle metodologie della ricerca aiutano il presente un argomento per prova ben fondata.

Vantaggi dei comandi di caricamento

Non riuscire a comprendere i comandi di caricamento quando effettua le tecniche occidentali della macchia può piombo per ricercare la pubblicazione perché non è verificato. Di conseguenza, un vantaggio di inclusione dei comandi di caricamento è che la ricerca risponde ai criteri per essere pubblicata.

Inoltre, i comandi di caricamento aggiungono al livello di qualità dei dati raccolti come possono essere utili nel correggere gli errori e nell'assicurazione dell'accuratezza delle informazioni usate per fare le conclusioni vitali. Risultati inconcludenti o sbagliati di limite di comandi di caricamento e quindi progetti di ricerca di risparmi tempo e moneta nel rifare le procedure.

In generale, i comandi di caricamento migliorano l'affidabilità ed il risparmio di temi dell'immunoblot e permettono agli studi facendo uso di loro di rispondere ai criteri per essere pubblicata.

Tipi di comandi di caricamento

Corrente, le numerose proteine sono usate come comandi di caricamento. Il tipo di proteina scelto per uso in uno studio dipenderà spesso da che cosa sta studiando e da che cosa è cercato per essere scoperto dal campione. I comandi più popolari sono:

Actina

la Intero-cella e le applicazioni citoplasmiche dell'estratto sono perfette per uso dell'actina. Tuttavia, perché è una componente di atto del muscolo, non può essere utilizzato nei campioni del muscolo scheletrico. L'actina esiste in molti moduli, rendente lo incredibilmente versatile.

Beta-Actina (kDa 42)

Un modulo popolare di actina è Beta-Actina (kDa 42). Può essere utilizzato in campioni di tutti i tipi eucariotici delle cellule, che è perché è una scelta popolare del campione di caricamento. Ulteriormente, i sui livelli di espressione non variano significativamente dovuto il trattamento cellulare, ancora rendentegli un controllo ampiamente adatto.

GAPDH

La deidrogenasi di fosfato della gliceraldeide 3, conosciuta come GAPDH, è una intero-cella e un controllo di caricamento citoplasmico dell'estratto. Egualmente funge da catalizzatore per la ripartizione delle molecole del carbonio e del glucosio. Il suo livello di espressione varia fra i tessuti, che è un fattore importante da considerare quando tenendo conto di come controllo di caricamento.

Porin

Porin è più comunemente usato in campioni delle proteine mitocondriali. È una proteina anione-selettiva tensione-dipendente del canale che è una componente di numerosi tipi del tessuto.

Lamin B1

Lamin B1 è considerato di svolgere un ruolo nella stabilità nucleare all'interno di una cella. È adatto come controllo di caricamento per le buste nucleari della proteina, ma dovrebbe essere usato soltanto se la busta nucleare è disponibile.

TBP

La proteina dell'Tata-associazione, conosciuta come TBP, è una proteina obbligatoria della trascrizione che funziona con il RNA polimerasi II. È un altro controllo di caricamento comune per le proteine nucleari.

Riassunto

Per misurare esattamente l'espressione della proteina e per leggere i risultati occidentali della macchia, l'uso dei comandi di caricamento è essenziale. Queste proteine sono usate per aumentare l'affidabilità ed il risparmio di temi globali dell'immunoblot e che permette che gli studi rispondano ai criteri per la pubblicazione. Mentre i numerosi comandi di caricamento esistono, alcuno del più comune include l'actina (specialmente il modulo dell'Beta-Actina), GAPDH, Porin, Lamin B1 e TBP.

Sorgenti:

  Eaton, S., Roche, S., Llavero Hurtado, M., Oldknow, K., Farquharson, C., Gillingwater, T. e Wishart, T. (2013). Analisi della proteina totale come controllo di caricamento affidabile per macchiare occidentale fluorescente quantitativo. PLoS UNO, 8(8), p.e72457. https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0072457

  Ghosh, R., Gilda, J. e Gomes, A. (2014). La necessità di e le strategie per il miglioramento della fiducia nell'accuratezza delle macchie occidentali. Rassegna esperta di Proteomics, 11(5), pp.549-560. https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1586/14789450.2014.939635

  Murphy, R. ed agnello, G. (2013). Considerazioni importanti per le analisi della proteina facendo uso alle delle tecniche basate a anticorpo: risultati macchianti occidentali di riduzione delle dimensioni di su-dimensioni. Il giornale di fisiologia, 591(23), pp.5823-5831. https://physoc.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1113/jphysiol.2013.263251

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Last Updated: Feb 7, 2020

Sarah Moore

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Sarah Moore

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