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Quelle est représentation d'E-FRET ?

RONGEZ, ou le transfert d'énergie fluorescent de résonance, est des techniques d'imagerie employées pour concevoir des interactions entre les protéines en temps réel. E-FRET est une version plus puissante de la FRETTE qui représente des faiblesses dans la méthode originelle de FRETTE, tenant compte pour plus de comparaisons entre les laboratoires et des mesures plus répétées.

E-FRET est une version plus puissante de FRETTE et est employé pour étudier des interactions de protéines.Carter Xunbin | Shutterstock

De la FRETTE à E-FRET

Dans la FRETTE traditionnelle, l'excitation d'un fluorophore, tel que le GFP situé sur une macromolécule mène à l'excitation étant transférée à un accepteur sur une autre macromolécule. Le passage du donneur à l'accepteur indique que les deux macromolécules agissent l'un sur l'autre. La FRETTE agit seulement très à courte portée, moins de 10 nanomètre, signifiant les macromolécules très proche agissent l'un sur l'autre entre eux et très probablement.

Cette interaction peut être imagée de trois voies différentes. On est trempage du fluorophore de distributeur qui peut être trouvé en mesurant la guérison de la fluorescence de distributeur quand l'accepteur photobleached.

Le deuxième est l'admission de la fluorescence d'accepteur de l'accepteur quand le donneur est excité. Pour finir, la vie et la polarisation de la fluorescence de distributeur, qui est modifiée pendant la FRETTE, peuvent être vues utilisant la microscopie de représentation de vie de fluorescence (FLIM).

La deuxième méthode devient de plus en plus populaire en partie parce qu'elle peut être appliquée aux cellules sous tension, à la différence de la première méthode. Cependant, les index de FRETTE mettent en boîte en raison hautement controversé des différences entre le donneur, l'accepteur, ou les deux qui sont employés pour dénommer l'index et en raison de photobleaching induit par la représentation répétée. E-FRET est une version personnalisée de FRETTE développée pour représenter ces éditions.

Éléments d'E-FRET

Pour mesurer exactement des interactions moléculaires, le rendement de FRETTE, qui dépend de l'instrument, doit être mesuré. Ce rendement est la proportion de conditions enthousiastes transférées de donneur avec l'accepteur, et peut être mesuré comme efficacité apparente ou absolue.

Quand les cellules sous tension de représentation avec des interactions dynamiques, seulement rendement relatif de FRETTE est possible, alors que l'efficacité absolue peut être mesurée utilisant les échantillons in vitro. E-FRET combine l'utilisation de la FRETTE basée sur les émissions sensibilisée pour l'usage en cellules sous tension avec des mesures d'efficacité absolue.

Dans E-FRET, le système de représentation est étalonné pour la relation entre le rendement et l'émission sensibilisée. Au total, trois images sont prises : Image du Danemark d'émission d'accepteur pendant l'excitation de distributeur, image d'aa de la fluorescence d'accepteur pendant l'excitation d'accepteur, et image de densité double de la fluorescence de distributeur pendant l'excitation de distributeur.

L'interférence spectrale entre trois images est comparée utilisant l'accepteur et les références de donneur. Les facteurs d'étalonnage du système sont alors déterminés par l'intermédiaire d'employer une référence combinée de donneur et d'accepteur.

Applications et développements

Utilisant E-FRET, un certain nombre de comportements et de structures de protéine peuvent être élucidés. Par exemple, E-FRET peut être employé pour montrer la structure des protéines, des interactions de récepteur et de ligand, des analyses de fusion de membrane, de la distribution des protéines dans une cellule dans l'espace et temporellement, et de la structure des acides nucléiques.

Actuel, la représentation d'E-FRET est faite manuellement où les prises complètes de chaque mesure de FRETTE environ 12 secondes pour un au courant desséché de chercheur du matériel et de l'évaluation de la FRETTE signalent. Car les mesures quantitatives dynamiques de FRETTE sont difficiles utilisant un microscope manuel de FRETTE, E-FRET a été récent automatisé. Cette version prend seulement trois secondes pour exécuter toutes les mesures nécessaires de FRETTE, et peut exécuté sur les cellules dynamiques et sous tension.

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Last Updated: Apr 10, 2019

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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