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Che cosa è la rappresentazione di E-FRET?

CORRODA, o il trasferimento di energia fluorescente di risonanza, è tecniche di rappresentazione usate per prevedere le interazioni fra le proteine in tempo reale. E-FRET è una versione più potente del CERCHIO che rappresenta le debolezze nel metodo originale del CERCHIO, tenendo conto più confronti fra i laboratori e le misure ripetute.

E-FRET è una versione più potente del CERCHIO ed è usato per studiare le interazioni della proteina.Pentola Xunbin | Shutterstock

Dal CERCHIO a E-FRET

In CERCHIO tradizionale, l'eccitazione di un fluorophore, quale GFP situato su una macromolecola piombo all'eccitazione che è trasferita ad un ricettore su un'altra macromolecola. L'opzione dal donatore al ricettore indica che le due macromolecole stanno interagendo. Il CERCHIO agisce soltanto a molto a corta portata, più di meno di 10 nanometro, significanti le macromolecole molto vicino l'un l'altro e molto probabilmente stanno interagendo.

Questa interazione può essere imaged in tre modi diversi. Uno è l'estinzione del fluorophore erogatore che può essere individuato misurando il ripristino della fluorescenza erogatrice quando il ricettore photobleached.

Il secondo è l'induzione della fluorescenza del ricettore del ricettore quando il donatore è emozionante. Infine, la vita e la polarizzazione della fluorescenza erogatrice, che è alterata durante il CERCHIO, possono essere vedute facendo uso di microscopia della rappresentazione di vita della fluorescenza (FLIM).

Il secondo metodo sta diventando parzialmente sempre più popolare perché può applicarsi alle celle in tensione, a differenza del primo metodo. Tuttavia, gli indici analitici del CERCHIO inscatolano altamente polemico dovuto le differenze fra il donatore, il ricettore, o entrambi che sono usando per denominare l'indice analitico e dovuto photobleaching indotto dalla rappresentazione ripetuta. E-FRET è una versione speciale del CERCHIO sviluppata per rappresentare queste emissioni.

Basi di E-FRET

Per misurare esattamente le interazioni molecolari, il risparmio di temi del CERCHIO, che dipende dallo strumento, deve essere misurato. Questo risparmio di temi è la percentuale di stati eccitati trasferiti dal donatore con ricettore e può essere misurato come l'efficienza evidente o assoluta.

Quando le celle in tensione della rappresentazione con le interazioni dinamiche, soltanto risparmio di temi relativo del CERCHIO è possibili, mentre l'efficienza assoluta può essere misurata facendo uso dei campioni in vitro. E-FRET combina l'uso del CERCHIO basato sulle emissioni sensibilizzato per uso in celle in tensione con le misure di efficienza assoluta.

In E-FRET, il sistema della rappresentazione è calibrato per la relazione fra risparmio di temi ed emissione sensibilizzata. Nel totale, tre immagini sono catturate: Immagine del DA dell'emissione del ricettore durante l'eccitazione erogatrice, immagine di aa di fluorescenza del ricettore durante l'eccitazione del ricettore ed immagine di DD di fluorescenza erogatrice durante l'eccitazione erogatrice.

L'interferenza spettrale fra tre immagini è confrontata facendo uso del ricettore e dei riferimenti del donatore. I fattori di calibratura del sistema poi sono determinati via usando un riferimento combinato del ricettore e del donatore.

Applicazioni e sviluppi

Facendo uso di E-FRET, una serie di comportamenti e strutture della proteina possono essere delucidati. Per esempio, E-FRET può essere usato per mostrare nello spazio e temporaneamente la struttura delle proteine, delle interazioni del legante e del ricevitore, delle analisi di fusione della membrana, della distribuzione delle proteine in una cella e della struttura degli acidi nucleici.

Corrente, la rappresentazione di E-FRET è fatta manualmente dove ogni misura completa del CERCHIO richiede intorno 12 secondi per un esperto familiare del ricercatore con la strumentazione e l'interpretazione del segnale del CERCHIO. Poichè le misure quantitative dinamiche del CERCHIO sono difficili facendo uso di un microscopio manuale del CERCHIO, E-FRET recentemente è stato automatizzato. Questa versione richiede soltanto tre secondi per realizzare tutte le misure necessarie del CERCHIO e può eseguito sulle celle dinamiche e in tensione.

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Last Updated: Apr 10, 2019

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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