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Que é imagem lactente de E-FRET?

DESGASTE, ou transferência de energia fluorescente da ressonância, é técnicas de imagem lactente usadas para visualizar interacções entre proteínas no tempo real. E-FRET é uma versão mais poderosa da FRICÇÃO que esclarece fraquezas no método original da FRICÇÃO, permitindo mais comparações entre laboratórios e medidas mais repetidas.

E-FRET é uma versão mais poderosa da FRICÇÃO e é usado para estudar interacções da proteína.Bandeja Xunbin | Shutterstock

Da FRICÇÃO a E-FRET

Na FRICÇÃO tradicional, a excitação de um fluoróforo, tal como GFP situado em uma macromolécula conduz à excitação que está sendo transferida a um autómato em uma outra macromolécula. O interruptor do doador ao autómato indica que as duas macromoléculas estão interagindo. A FRICÇÃO actua somente em muito shortrange, menos de 10 nanômetro, significando as macromoléculas muito próximo estão interagindo entre si e muito provavelmente.

Esta interacção pode ser imaged em três maneiras diferentes. Um é extinguir do fluoróforo fornecedor que pode ser detectado medindo a recuperação da fluorescência fornecedora quando o autómato photobleached.

O segundo é a indução da fluorescência do autómato do autómato quando o doador é entusiasmado. Última, a vida e a polarização da fluorescência fornecedora, que é alterada durante a FRICÇÃO, podem ser consideradas usar a microscopia da imagem lactente da vida da fluorescência (FLIM).

O segundo método está tornando-se cada vez mais popular em parte porque pode ser aplicado às pilhas vivas, ao contrário do primeiro método. Contudo, os deslocamentos predeterminados da FRICÇÃO enlatam altamente controverso devido às diferenças entre o doador, o autómato, ou ambos que estão sendo usados para denominar o deslocamento predeterminado e devido a photobleaching induzido pela imagem lactente repetida. E-FRET é uma versão especial da FRICÇÃO desenvolvida para esclarecer estas edições.

Princípios de E-FRET

Para medir exactamente interacções moleculars, a eficiência da FRICÇÃO, que depende do instrumento, deve ser medida. Esta eficiência é a proporção de estados entusiasmado transferidos do doador ao autómato, e pode ser medida como a eficiência aparente ou absoluta.

Quando as pilhas vivas da imagem lactente com interacções dinâmicas, somente eficiência relativa da FRICÇÃO forem possíveis, visto que a eficiência absoluta pode ser medida usando in vitro amostras. E-FRET combina o uso da FRICÇÃO baseada nas emissões sensibilizada para o uso em pilhas vivas com as medidas da eficiência absoluta.

Em E-FRET, o sistema da imagem lactente é calibrado para o relacionamento entre a eficiência e a emissão sensibilizada. No total, três imagens são tomadas: Imagem da Dinamarca da emissão do autómato durante a excitação fornecedora, imagem do AA da fluorescência do autómato durante a excitação do autómato, e imagem do DD da fluorescência fornecedora durante a excitação fornecedora.

A interferência espectral entre três imagens é comparada usando o autómato e as referências do doador. Os factores da calibração do sistema são determinados então através de usar uma referência combinada do doador e do autómato.

Aplicações e revelações

Usando E-FRET, um número comportamentos da proteína e de estruturas podem ser explicados. Por exemplo, E-FRET pode ser usado para mostrar espacial e temporal a estrutura das proteínas, das interacções do receptor e da ligante, dos ensaios da fusão da membrana, da distribuição das proteínas em uma pilha, e da estrutura de ácidos nucleicos.

Actualmente, a imagem lactente de E-FRET é feita manualmente onde cada medida completa da FRICÇÃO toma ao redor 12 segundos para um familiar temperado do pesquisador com o equipamento e a interpretação do sinal da FRICÇÃO. Porque as medidas quantitativas dinâmicas da FRICÇÃO são difíceis usando um microscópio manual da FRICÇÃO, E-FRET tem sido automatizado recentemente. Esta versão toma somente três segundos para executar todas as medidas necessárias da FRICÇÃO, e pode executado em pilhas dinâmicas, vivas.

Fontes

Further Reading

Last Updated: Apr 10, 2019

Sara Ryding

Written by

Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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