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¿Cuál es proyección de imagen de E-FRET?

PREOCÚPESE, o la transferencia de energía fluorescente de resonancia, es técnicas de una proyección de imagen usadas para visualizar acciones recíprocas entre las proteínas en tiempo real. E-FRET es una versión más potente del TRASTE que explica debilidades en el método original del TRASTE, teniendo en cuenta para más comparaciones entre los laboratorios y mediciones relanzadas.

E-FRET es una versión más potente del TRASTE y se utiliza para estudiar acciones recíprocas de la proteína.Cubeta Xunbin | Shutterstock

De TRASTE a E-FRET

En TRASTE tradicional, la excitación de un fluoróforo, tal como GFP situado en una macromolécula lleva a la excitación que es transferida a un aceptor en otra macromolécula. El interruptor del donante al aceptor indica que están obrando recíprocamente las dos macromoléculas. El TRASTE actúa solamente en muy de corto alcance, menos de 10 nanómetro, significando las macromoléculas muy cercano están obrando recíprocamente el uno al otro y muy probablemente.

Esta acción recíproca puede ser reflejada en tres maneras diferentes. Uno es enfriamiento del fluoróforo dispensador de aceite que puede ser descubierta midiendo la recuperación de la fluorescencia dispensadora de aceite cuando el aceptor photobleached.

El segundo es la inducción de la fluorescencia del aceptor del aceptor cuando el donante es emocionado. Pasado, el curso de la vida y la polarización de la fluorescencia dispensadora de aceite, que se altera durante TRASTE, se pueden considerar usando microscopia de la proyección de imagen del curso de la vida de la fluorescencia (FLIM).

El segundo método está llegando a ser cada vez más popular en parte porque puede ser aplicado a las células vivas, a diferencia del primer método. Sin embargo, los índices del TRASTE pueden altamente discutible debido a las diferencias entre el donante, el aceptor, o ambos que son utilizados para denominar el índice y debido a photobleaching inducido por proyección de imagen relanzada. E-FRET es una versión especial del TRASTE desarrollada para explicar estas entregas.

Fundamentos de E-FRET

Para medir exacto acciones recíprocas moleculares, la eficiencia del TRASTE, que depende del instrumento, debe ser medida. Esta eficiencia es la proporción de estados emocionados transferidos del donante al aceptor, y se puede medir como la eficacia evidente o absoluta.

Cuando las células vivas de la proyección de imagen con acciones recíprocas dinámicas, solamente eficiencia relativa del TRASTE son posibles, mientras que la eficacia absoluta se puede medir usando muestras ines vitro. E-FRET combina el uso del TRASTE basado en las emisiones sensibilizado para el uso en células vivas con mediciones de la eficacia absoluta.

En E-FRET, el sistema de la proyección de imagen se calibra para el lazo entre la eficiencia y la emisión sensibilizada. En total, se toman tres imágenes: Imagen de DA de la emisión del aceptor durante la excitación dispensadora de aceite, imagen del AA de la fluorescencia del aceptor durante la excitación del aceptor, e imagen de la DD de la fluorescencia dispensadora de aceite durante la excitación dispensadora de aceite.

La diafonía espectral entre tres imágenes se compara usando aceptor y referencias del donante. Los factores de la calibración del sistema entonces se determinan vía usar una referencia combinada del donante y del aceptor.

Usos y progresos

Usando E-FRET, varios comportamientos y estructuras de la proteína pueden ser aclarados. Por ejemplo, E-FRET se puede utilizar para mostrar la estructura de proteínas, de acciones recíprocas del receptor y del ligand, de los análisis de la fusión de la membrana, de la distribución de proteínas en una célula espacial y temporal, y de la estructura de ácidos nucléicos.

Actualmente, la proyección de imagen de E-FRET se hace manualmente donde cada medición completa del TRASTE tarda alrededor 12 segundos para un familiar sazonado del investigador con el equipo y la interpretación de la señal del TRASTE. Pues las mediciones cuantitativas dinámicas del TRASTE son difíciles usando un microscopio manual del TRASTE, E-FRET se ha automatizado recientemente. Esta versión tarda solamente tres segundos para realizar todas las mediciones necesarias del TRASTE, y puede realizado en las células dinámicas, vivas.

Fuentes

Further Reading

Last Updated: Apr 10, 2019

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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