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Quel est Western blotting fluorescent ?

Éponger occidental fluorescent est une technique puissante de dépistage de protéine qui offre de nombreux avantages par rapport aux systèmes de dépistage chimioluminescents ou chromogènes alternatifs. Il produit moins de déchet chimique, est plus rapide, et est une méthode fiable de rassembler des caractéristiques quantitatives.

tache occidentaleCrédit d'image : ArtPanupat/Shutterstock.com

De plus, les avancements en technologie ont augmenté la sensibilité de la technique, ainsi que réduisant son coût. Ce qui est plus, la technique peut être employée pour trouver les protéines multiples simultanément, et pour ces raisons, le Western blotting fluorescent se lève dans la popularité.

Comment cela fonctionne

Afin de trouver la présence des protéines spécifiques, le système épongeant occidental fluorescent s'approprie le composé d'antigène-anticorps, juste comme le colorimétrique alternatif et les méthodes épongeantes occidentales chimioluminescentes font.

Cependant, plutôt que produisant signale en raison des produits des réactions d'enzyme/substrate, de même que la méthode d'éponger occidental colorimétrique et chimioluminescent, occidentaux fluorescents épongeant, en revanche, des saisies signalent sous forme de lumière. Un fluorophore, une molécule par nature fluorescente, produit l'émission légère passagère pendant qu'elle relâche des photons quand elle revient à sa condition enthousiaste après l'excitation.

Le procédé concerne séparer les protéines spécifiques par l'électrophorèse et les immobiliser sur une membrane épongeante, les préparant pour l'enquête. Le dépistage de la protéine est alors réalisé en ajoutant une teinture fluorescente, qui est excitée en l'exposant à une source de lumière appropriée. La lumière à la longueur d'onde adaptée est absorbée par la teinture, excitant la molécule fluorescente, relâchant des photons pendant qu'elle revient à sa condition électronique au sol. Une encre en poudre digitale est alors employée pour trouver la lumière émise, détectant la présence de la protéine.

L'optimisation est également une étape importante du système épongeant occidental fluorescent, juste comme elle est avec les méthodes basées sur réaction d'enzymes alternatives. Le degré de marquage fluorescent doit être juste juste de produire du niveau de signe optimal : s'il est trop peu, alors le signe est trop faible, et s'il est excessif le signe est de nouveau trop faible à cause de l'inactivation résultante du réactif de dépistage.

En conclusion, il est nécessaire pour des chercheurs employant la méthode épongeante occidentale fluorescente pour prendre la considération spéciale dont les matériaux ils sélectent comme membranes. Ceux qui sont les plus courants dans d'autres méthodes, telles que le difluoride de nitrocellulose et de polyvinylidène (PVDF), ont eux-mêmes les propriétés fluorescentes obtenues.

Utilisant ces matériaux dans éponger occidental fluorescent produit des signes de mouvement propre qui nuisent le relevé des caractéristiques réelles. Afin de traiter ce problème, des réactifs spécifiques ont été produits pour l'usage dans cette méthode, ceux qui ont certaines longueurs d'onde d'excitation et d'émission qui réduisent l'automatique-fluorescence des membranes courantes. De plus, des membranes spécifiques d'inférieur-fluorescence ont été également produites pour venir à bout ce problème.

Saisie de données

Le matériel spécial de représentation de fluorescence est exigé pour indiquer et documenter la lumière émise par le procédé épongeant occidental fluorescent. Le matériel de représentation de fluorescence vient habituellement sous forme d'instrument d'illumination, laser ou source lumineuse Aboutir, et filtre qui s'assure que la longueur d'onde légère correcte est fournie à l'échantillon, ainsi que laissant pour la saisie de la longueur d'onde nécessaire dans la sortie d'émission.

Les instruments actuels emploient en grande partie un appareil-photo (CCD) dispositif dispositif à couplage de charge pour enregistrer le signe, signifiant que la caractéristique est procurable dans un format numérique.

Car éponger occidental fluorescent a la capacité du dépistage multiplex, tenant compte pour que les objectifs multiples soient recensés simultanément, d'autres outils sont nécessaires pour analyser les teintures fluorescentes multiples employées pour trouver les objectifs distincts. Le plus couramment, des outils en ligne sont utilisés pour faciliter le choix de Commission pour le dépistage multiplex de fluorescence.

Avantages de dépistage occidental fluorescent de tache

La méthode de dépistage occidental fluorescent de tache a plusieurs avantages par rapport à l'alternative, méthodes de dépistage basées sur enzyme. Ces avantages aident à la déterminer comme méthode de plus en plus populaire de dépistage de protéine.

Comme discuté, le dépistage des protéines multiples est facilement réalisable avec la méthode occidentale fluorescente de tache. De juste une tache unique, des protéines multiples peuvent être trouvées en même temps utilisant les teintures spectralement distinctes qui émettent la lumière aux longueurs d'onde de signature, tenant compte pour que des objectifs multiples soient enregistrés sans besoin de contrôle indépendant.

La méthode est également considérée couronnée de succès à fournir des caractéristiques quantitatives fiables. On l'a vu que les niveaux du signe produits sont proportionnels au volume de protéine dans l'échantillon. Des protéines qui sont toutes deux en abondance, ou seulement peu abondamment dispersé dans un échantillon peuvent être exactement recensées, donnant le pouvoir de méthode dans le dépistage quantitatif. En comparaison des systèmes alternatifs d'enzymes, éponger occidental fluorescent peut avoir comme conséquence des caractéristiques plus quantitatives.

En outre, la méthode a l'avantage du temps de chercheurs de sauvetage. Elle peut faire ceci des voies multiples. Premièrement, parce qu'elle peut trouver de nombreuses protéines cibles de juste un échantillon de tache, plutôt que les tests multiples de conduite. Deuxièmement, parce qu'avec ce genre de contrôle, il n'y a aucun besoin d'allouer le temps aux expositions d'incubation ou de film de substrat.

Suite à ceci, l'utilisation des teintures fluorescentes particulières a été prouvée pour être élevée dans la sensibilité, menant à une méthode robuste de dépistage de protéine. À cause de leur autofluorescence inférieur de mouvement propre, la fluorescence inférieure se trempant, et la teinture fluorescente de coefficients d'extinction, loin-rouge et infrarouge élevée conjugue le résultat dans une sensibilité plus grande de dépistage.

Éponger occidental général et fluorescent s'est déterminé comme méthode robuste de dépistage de protéine pendant qu'il offre de nombreux avantages au-dessus des approches alternatives, telles que la capacité de trouver les protéines multiples simultanément, sa sensibilité élevée, et les procédés qui économise. Le résultat est que ce devient une technique de plus en plus populaire pour le dépistage de protéine.

Sources :

  • Eaton, S., Roche, S., Llavero Hurtado, M., Oldknow, K., Farquharson, C., Gillingwater, T., et Wishart, T. (2013). Analyse de protéine totale comme contrôle de charge fiable pour le Western blotting fluorescent quantitatif. PLoS UN, 8(8), p.e72457. https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0072457
  • Jacksonimmuno.com. (2019). [en ligne] procurable à : https://jacksonimmuno.com/secondary-antibody-resource/immuno-techniques/fluorescent-western-blotting/?pdf=126 [consulté le 17 octobre 2019].
  • Towbin, H., Staehelin, T., et Gordon, J. (1979). Transfert électrophorétique des protéines à partir des gels de polyacrylamide aux feuilles de nitrocellulose : procédure et quelques applications. Démarches de l'académie nationale des sciences, 76(9), pp.4350-4354. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/388439
  • Ni, D., Xu, P., et Gallagher, S. (2016). Immunoempreinte et Immunodetection. Protocoles actuels en immunologie, 114(1), pp.8.10.1-8.10.36. https://currentprotocols.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/cpim.10

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Last Updated: Dec 12, 2019

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