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Che cosa occidentale fluorescente sta macchiando?

Macchiare occidentale fluorescente è una tecnica potente di rilevazione della proteina che offre i numerosi vantaggi rispetto ai sistemi di rilevamento chemiluminescenti o cromogeni alternativi. Produce meno rifiuti chimici, è più veloce ed è un metodo attendibile di raccolta dei dati quantitativi.

macchia occidentaleCredito di immagine: ArtPanupat/Shutterstock.com

Inoltre, gli avanzamenti nella tecnologia hanno aumentato la sensibilità della tecnica come pure diminuendo il suo costo. Che cosa è più, la tecnica può essere usata per individuare simultaneamente le proteine multiple e per queste ragioni, macchiare occidentale fluorescente sta aumentando nella popolarità.

Come funziona

Per individuare la presenza di proteine specifiche, il sistema macchiante occidentale fluorescente si appropria il complesso dell'antigene-anticorpo, appena come il colorimetrico alternativo ed i metodi macchianti occidentali chemiluminescenti fanno.

Tuttavia, piuttosto che producendo segnala come conseguenza dei prodotti delle reazioni di enzima-substrato, come è il metodo di macchiare occidentale colorimetrico e chemiluminescente, occidentali fluorescenti macchiando, al contrario, i bloccaggi segnalano sotto forma di indicatore luminoso. Un fluorophore, una molecola inerentemente fluorescente, produce l'emissione di luce transitoria mentre rilascia i fotoni quando ritorna al suo stato eccitato dopo l'eccitazione.

Il trattamento comprende separare le proteine specifiche con l'elettroforesi e vincolarli su una membrana macchiante, preparante li per la ricerca. La rilevazione della proteina poi è raggiunta aggiungendo una tintura fluorescente, che è eccitata esponendola ad una fonte luminosa appropriata. L'indicatore luminoso alla lunghezza d'onda adatta è assorbito dalla tintura, eccitando la molecola fluorescente, rilasciante i fotoni mentre ritorna al suo stato elettronico al suolo. Un toner digitale poi è usato per individuare l'indicatore luminoso emesso, percepente la presenza della proteina.

L'ottimizzazione è egualmente una fase importante del sistema macchiante occidentale fluorescente, appena poichè è con ai i metodi basati a reazione degli enzimi alternativi. Il grado di contrassegno fluorescente deve avere solo ragione da generare il livello di segnale ottimale: se è troppo poco, quindi il segnale è troppo debole e se è troppo il segnale è ancora troppo debole a causa di inattivazione risultante del reagente di rilevazione.

Per concludere, è necessario per i ricercatori che usando il metodo macchiante occidentale fluorescente per catturare la considerazione speciale di quali materiali selezionano come membrane. Quelli che sono i più comuni in altri metodi, quale il difluoruro del polivinilidene e della nitrocellulosa (PVDF), hanno stessi proprietà fluorescenti ottenute.

Facendo uso di questi materiali nel macchiare occidentale fluorescente genera i segnali di sfondo che alterano la lettura dei dati reali. Per affrontare questo problema, i reagenti specifici sono stati creati per uso in questo metodo, quelli che hanno determinate lunghezze d'onda dell'emissione e di eccitazione che diminuiscono la automatico-fluorescenza dalle membrane comuni. Inoltre, le membrane specifiche della basso fluorescenza egualmente sono state create per ottenere intorno a questo problema.

Acquisizione di dati

La strumentazione speciale della rappresentazione della fluorescenza è richiesta di indicare e documentare l'indicatore luminoso emesso con il trattamento macchiante occidentale fluorescente. La strumentazione della rappresentazione della fluorescenza viene solitamente sotto forma di strumento dell'illuminazione, un laser o una sorgente luminosa piomba Piombo e un filtro che assicura che la lunghezza d'onda leggera corretta sia consegnata al campione come pure concedendo per il bloccaggio della lunghezza d'onda necessaria nell'output dell'emissione.

Gli strumenti correnti principalmente usano una macchina fotografica (CCD) unità unità ad accoppiamento di carica per registrare il segnale, significante che i dati sono disponibili in un formato digitale.

Poichè macchiare occidentale fluorescente ha la capacità di rilevazione multipla, tenendo conto gli obiettivi multipli essere identificato simultaneamente, ulteriori strumenti sono necessari da analizzare le tinture fluorescenti multiple usate per individuare gli obiettivi distinti. Il più comunemente, gli strumenti online sono impiegati per facilitare la selezione del comitato per rilevazione multipla della fluorescenza.

Vantaggi di rilevazione occidentale fluorescente della macchia

Il metodo di rilevazione occidentale fluorescente della macchia presenta parecchi vantaggi sopra ai i metodi di rilevazione alternativi e basati a enzima. Questi vantaggi stanno contribuendo a stabilirlo come metodo sempre più popolare di rilevazione della proteina.

Come discusso, la rilevazione delle proteine multiple è facilmente realizzabile con l'immunoblot fluorescente. Da appena una singola macchia, le proteine multiple possono essere individuate allo stesso tempo facendo uso delle tinture spettrale distinte che emettono l'indicatore luminoso alle lunghezze d'onda dell'impronta, tenendo conto gli obiettivi multipli essere registrato senza l'esigenza della prova separata.

Il metodo egualmente è considerato come riuscito a fornire i dati quantitativi affidabili. È stato veduto che i livelli di segnale prodotti sono proporzionali al volume di proteina nel campione. Le proteine che sono entrambe in abbondanza, o disperso soltanto scarsamente in un campione possono essere identificate esattamente, dando la potenza di metodo nella rilevazione quantitativa. In confronto ai sistemi alternativi degli enzimi, macchiare occidentale fluorescente può provocare i dati più quantitativi.

Inoltre, il metodo presenta il vantaggio di tempo dei ricercatori di risparmio. Può fare questo nei modi multipli. In primo luogo, perché può individuare le numerose proteine bersaglio da appena un campione della macchia, piuttosto che le prove multiple di conduzione. Secondariamente, perché con questo genere di prova, non c'è necessità di assegnare il tempo alle esposizioni di incubazione o della pellicola del substrato.

Più ulteriormente a questo, l'uso delle tinture fluorescenti particolari è stato dimostrato essere alto nella sensibilità, piombo ad un metodo robusto di rilevazione della proteina. A causa del loro autofluorescence basso di sfondo, la fluorescenza bassa che estiguono e l'alta tintura fluorescente lontano-rossa ed infrarossa di coefficienti di estinzione, coniuga il risultato nella maggior sensibilità di rilevazione.

Macchiare occidentale globale e fluorescente si è stabilito come metodo robusto di rilevazione della proteina mentre offre i numerosi vantaggi sopra i metodi alternativi, quale la capacità di individuare simultaneamente le proteine multiple, la sua alta sensibilità ed i trattamenti risparmiatori di tempo. Il risultato è che sta trasformandosi in in una tecnica sempre più popolare per rilevazione della proteina.

Sorgenti:

  • Eaton, S., Roche, S., Llavero Hurtado, M., Oldknow, K., Farquharson, C., Gillingwater, T. e Wishart, T. (2013). Analisi della proteina totale come controllo di caricamento affidabile per macchiare occidentale fluorescente quantitativo. PLoS UNO, 8(8), p.e72457. https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0072457
  • Jacksonimmuno.com. (2019). [online] disponibile a: https://jacksonimmuno.com/secondary-antibody-resource/immuno-techniques/fluorescent-western-blotting/?pdf=126 [raggiunto il 17 ottobre 2019].
  • Towbin, H., Staehelin, T. e Gordon, J. (1979). Trasferimento elettroforetico delle proteine dai gel di poliacrilammide nelle lamiere sottili della nitrocellulosa: procedura ed alcune applicazioni. Atti dell'Accademia nazionale delle scienze, 76(9), pp.4350-4354. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/388439
  • Ni, D., Xu, P. e Gallagher, S. (2016). Immunoblotting e Immunodetection. Protocolli correnti in immunologia, 114(1), pp.8.10.1-8.10.36. https://currentprotocols.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/cpim.10

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Last Updated: Dec 12, 2019

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