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Que ocidental fluorescente está borrando?

A mancha ocidental fluorescente é uma técnica poderosa da detecção da proteína que ofereça benefícios numerosos em comparação com sistemas de detecção quimiluminescentes ou cromogéneos alternativos. Produz menos desperdício químico, é mais rápida, e é um método seguro de recolher dados quantitativos.

mancha ocidentalCrédito de imagem: ArtPanupat/Shutterstock.com

Além, os avanços na tecnologia aumentaram a sensibilidade da técnica, assim como reduzindo seu custo. O que é mais, a técnica pode ser usada para detectar simultaneamente proteínas múltiplas, e por estas razões, a mancha ocidental fluorescente está aumentando na popularidade.

Como trabalha

A fim detectar a presença de proteínas específicas, o sistema de mancha ocidental fluorescente apropria o complexo do antígeno-anticorpo, apenas como o colorimetric alternativo e os métodos de mancha ocidentais quimiluminescentes fazem.

Contudo, um pouco do que produzindo sinaliza em conseqüência dos produtos de reacções da enzima-carcaça, como é o método da mancha ocidental colorimetric e quimiluminescente, ocidentais fluorescentes borrando, ao contrário, captações sinalizam sob a forma da luz. Uma fluorófora, uma molécula inerente fluorescente, produz a emissão clara transiente enquanto libera fotão quando retorna a seu estado entusiasmado depois da excitação.

O processo envolve separar proteínas específicas com a electroforese e imobilizá-los em uma membrana de mancha, preparando os para a investigação. A detecção da proteína é conseguida então adicionando uma tintura fluorescente, que seja entusiasmado expor à uma fonte de luz apropriada. A luz no comprimento de onda apropriado está absorvida pela tintura, excitando a molécula fluorescente, liberando fotão enquanto retorna a seu estado eletrônico à terra. Um tonalizador digital é usado então para detectar a luz emissora, detectando a presença da proteína.

A optimização é igualmente uma fase importante do sistema de mancha ocidental fluorescente, apenas porque é com enzima alternativa os métodos reacção-baseados. O grau de rotulagem fluorescente deve ser apenas certo gerar o nível de sinal óptimo: se é demasiado pequeno, a seguir o sinal é demasiado fraco, e se é demasiado o sinal é outra vez demasiado fraco devido à inactivação resultante do reagente da detecção.

Finalmente, é necessário para os pesquisadores que usam o método de mancha ocidental fluorescente para tomar a consideração especial de que os materiais eles seleccionam como as membranas. Aqueles que são as mais comuns em outros métodos, tais como o difluoride da nitrocelulose e do polyvinylidene (PVDF), têm eles mesmos propriedades fluorescentes obtidas.

Usar estes materiais na mancha ocidental fluorescente gera os sinais de fundo que danificam a leitura de dados reais. A fim endereçar este problema, os reagentes específicos foram criados para o uso neste método, aqueles que têm determinados comprimentos de onda da excitação e da emissão que reduzem a auto-fluorescência das membranas comuns. Além, as membranas específicas da baixo-fluorescência foram criadas igualmente para obter em torno deste problema.

Captação de dados

O equipamento especial da imagem lactente da fluorescência é exigido ler e documentar a luz emissora com o processo de mancha ocidental fluorescente. O equipamento da imagem lactente da fluorescência vem geralmente sob a forma de um instrumento da iluminação, um laser ou uma fonte luminosa Conduzir-baseada, e um filtro que se assegure de que o comprimento de onda claro correcto esteja entregado à amostra, assim como reservando para a captação do comprimento de onda necessário na saída da emissão.

Os instrumentos actuais usam na maior parte uma câmera (CCD) dispositivo-baseada carga-acoplada para gravar o sinal, significando que os dados estão disponíveis em um formato digital.

Porque a mancha ocidental fluorescente tem a capacidade da detecção multiplex, permitindo alvos múltiplos ser identificado simultaneamente, umas ferramentas mais adicionais são necessárias para analisar as tinturas fluorescentes múltiplas usadas para detectar alvos distintos. O mais geralmente, as ferramentas em linha são empregadas para ajudar à selecção do painel para a detecção multiplex da fluorescência.

Benefícios da detecção ocidental fluorescente da mancha

O método da detecção ocidental fluorescente da mancha tem diversas vantagens sobre a alternativa, métodos de detecção enzima-baseados. Estes benefícios estão ajudando a estabelecê-lo como um método cada vez mais popular da detecção da proteína.

Como discutido, a detecção de proteínas múltiplas é facilmente realizável com o método ocidental fluorescente da mancha. De apenas uma única mancha, as proteínas múltiplas podem ser detectadas ao mesmo tempo usar spectrally as tinturas distintas que se emitem a luz em comprimentos de onda da assinatura, reservando para que os alvos múltiplos sejam registrados sem a necessidade para o teste separado.

O método é considerado igualmente ser bem sucedido em fornecer dados quantitativos seguros. Viu-se que os níveis de sinal produzidos são proporcionais ao volume de proteína na amostra. As proteínas que são ambas em abundância, ou somente dispersado escassa em uma amostra podem exactamente ser identificadas, dando a potência do método na detecção quantitativa. Em comparação com os sistemas alternativos da enzima, a mancha ocidental fluorescente pode conduzir a uns dados mais quantitativos.

Também, o método tem a vantagem do tempo dos pesquisadores da economia. Pode fazer este em maneiras múltiplas. Em primeiro lugar, porque pode detectar proteínas numerosas do alvo de apenas uma amostra da mancha, um pouco do que testes múltiplos de condução. Em segundo lugar, porque com este tipo do teste, não há nenhuma necessidade de atribuir o tempo às exposições da incubação ou do filme da carcaça.

Mais a este, o uso de tinturas fluorescentes particulares foi provado ser alto na sensibilidade, conduzindo a um método robusto da detecção da proteína. Devido a seu baixo autofluorescence do fundo, a baixa fluorescência que extinguem, e a tintura fluorescente alta de coeficientes de extinção, distante-vermelha e infravermelha conjugam o resultado na maior sensibilidade da detecção.

A mancha ocidental total, fluorescente estabeleceu-se como um método robusto da detecção da proteína enquanto oferece benefícios numerosos sobre métodos alternativos, tais como a capacidade para detectar simultaneamente proteínas múltiplas, sua sensibilidade alta, e processos da tempo-economia. O resultado é que se está transformando uma técnica cada vez mais popular para a detecção da proteína.

Fontes:

  • Eaton, S., Roche, S., Llavero Hurtado, M., Oldknow, K., Farquharson, C., Gillingwater, T., e Wishart, T. (2013). Análise da proteína total como um controle de carga seguro para a mancha ocidental fluorescente quantitativa. PLoS UM, 8(8), p.e72457. https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0072457
  • Jacksonimmuno.com. (2019). [em linha] disponível em: https://jacksonimmuno.com/secondary-antibody-resource/immuno-techniques/fluorescent-western-blotting/?pdf=126 [alcançado 17 de outubro de 2019].
  • Towbin, H., Staehelin, T., e Gordon, J. (1979). Transferência Electrophoretic das proteínas dos geles de polyacrylamide às folhas da nitrocelulose: procedimento e algumas aplicações. Continuações da Academia Nacional das Ciências, 76(9), pp.4350-4354. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/388439
  • Ni, D., Xu, P., e Gallagher, S. (2016). Immunoblotting e Immunodetection. Protocolos actuais na imunologia, 114(1), pp.8.10.1-8.10.36. https://currentprotocols.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/cpim.10

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Last Updated: Dec 12, 2019

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