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¿Qué occidental fluorescente está borrando?

El borrar occidental fluorescente es una técnica potente de la detección de la proteína que ofrece ventajas numerosas con respecto a sistemas de detección quimioluminescentes o cromogénicos alternativos. Produce menos desecho químico, es más rápido, y es un método de confianza de cerco datos cuantitativos.

mancha blanca /negra occidentalHaber de imagen: ArtPanupat/Shutterstock.com

Además, los adelantos en tecnología han aumentado la sensibilidad de la técnica, así como reduciendo su costo. Cuál es más, la técnica se puede utilizar para descubrir las proteínas múltiples simultáneamente, y por estas razones, el borrar occidental fluorescente está subiendo en renombre.

Cómo trabaja

Para descubrir la presencia de proteínas específicas, el sistema que borra occidental fluorescente se apropia del complejo del antígeno-anticuerpo, apenas como el colorimétrico alternativo y los métodos que borran occidentales quimioluminescentes hacen.

Sin embargo, bastante que produciendo hace señales como resultado de productos de las reacciones del sustrato enzimático, al igual que el método de borrar occidental colorimétrico y quimioluminescente, occidentales fluorescentes borrando, en cambio, capturas hacen señales bajo la forma de luz. Un fluoróforo, una molécula intrínsecamente fluorescente, produce la emisión liviana transitoria mientras que libera los fotones cuando vuelve a su estado emocionado después de la excitación.

El proceso implica el separar de las proteínas específicas con electroforesis y el inmovilizar de ellos en una membrana que borra, preparándolos para la investigación. La detección de la proteína entonces es lograda agregando un tinte fluorescente, que es excitado exponiéndola a una fuente de la luz apropiada. La luz en la longitud de onda conveniente es absorbida por el tinte, excitando la molécula fluorescente, liberando los fotones mientras que vuelve a su estado electrónico de tierra. Un toner digital entonces se utiliza para descubrir la luz emitida, detectando la presencia de la proteína.

La optimización es también un escenario importante del sistema que borra occidental fluorescente, apenas pues está con los métodos reacción-basados enzima alternativa. El grado de etiqueta fluorescente debe ser apenas a la derecha generar el nivel de señal óptimo: si es demasiado poco, después la señal es demasiado débil, y si es demasiada la señal es otra vez demasiado débil debido a la desactivación resultante del reactivo de la detección.

Finalmente, es necesario para los investigadores que usan el método que borra occidental fluorescente para tomar la consideración especial cuyo los materiales ellos seleccionan como membranas. Los que son la mas comunes de otros métodos, tales como difluoride de la nitrocelulosa y del polivinilideno (PVDF), tienen ellos mismos propiedades fluorescentes conseguidas.

Usando estos materiales en borrar occidental fluorescente genera las señales de fondo que empeoran la lectura de datos reales. Para abordar este problema, los reactivos específicos se han creado para el uso en este método, los que tienen ciertas longitudes de onda de la excitación y de la emisión que reduzcan auto-fluorescencia de las membranas comunes. Además, las membranas específicas de la inferior-fluorescencia también se han creado para conseguir alrededor de este problema.

Recogida de datos

El equipo especial de la proyección de imagen de la fluorescencia se requiere leer y documentar la luz emitida con el proceso que borra occidental fluorescente. El equipo de la proyección de imagen de la fluorescencia viene generalmente bajo la forma de instrumento de la iluminación, un laser o una fuente de luz Llevar-basada, y un filtro que se asegure de que la longitud de onda liviana correcta esté entregada a la muestra, así como permitiendo para la captura de la longitud de onda necesaria en el rendimiento de la emisión.

Los instrumentos actuales utilizan sobre todo una cámara (CCD) dispositivo-basada acoplada de carga eléctrica para registrar la señal, significando que los datos están disponibles en un formato digital.

Pues el borrar occidental fluorescente tiene la capacidad de la detección múltiplex, teniendo en cuenta para que los objetivos múltiples sean determinados simultáneamente, otras herramientas son necesarias analizar los tintes fluorescentes múltiples usados para descubrir objetivos distintos. Lo más común posible, las herramientas en línea se emplean para ayudar a la selección del panel para la detección múltiplex de la fluorescencia.

Ventajas de la detección occidental fluorescente de la mancha blanca /negra

El método de detección occidental fluorescente de la mancha blanca /negra tiene varias ventajas sobre la opción, métodos de detección enzima-basados. Estas ventajas están ayudando a establecerlo como método cada vez más popular de detección de la proteína.

Según lo discutido, la detección de proteínas múltiples es fácilmente realizable con el método occidental fluorescente de la mancha blanca /negra. De apenas una única mancha blanca /negra, las proteínas múltiples se pueden descubrir al mismo tiempo usando los tintes espectral distintos que emiten la luz en las longitudes de onda de la firma, teniendo en cuenta para que los objetivos múltiples sean registrados sin la necesidad de la prueba separada.

El método también se considera ser acertado en ofrecer datos cuantitativos seguros. Se ha visto que los niveles de señal producidos son proporcionales al volumen de proteína en la muestra. Las proteínas que están ambas en abundancia, o dispersado solamente escaso en una muestra se pueden determinar exacto, dando la potencia del método en la detección cuantitativa. En comparación con los sistemas alternativos de la enzima, el borrar occidental fluorescente puede dar lugar a datos más cuantitativos.

También, el método tiene la ventaja del tiempo de los investigadores del ahorro. Puede hacer esto de maneras múltiples. En primer lugar, porque puede descubrir las proteínas numerosas del objetivo de apenas una muestra de la mancha blanca /negra, bastante que pruebas múltiples de conducto. En segundo lugar, porque con esta clase de prueba, no hay necesidad de dotar tiempo a las exposiciones de la incubación o de la película del substrato.

Siguiendo esto, el uso de tintes fluorescentes determinados se ha demostrado ser alto en la sensibilidad, llevando a un método robusto de detección de la proteína. Debido a su autofluorescence inferior del fondo, la fluorescencia inferior que apaga, y el alto tinte fluorescente de los coeficientes de extinción, lejos-rojo e infrarrojo conjuga resultado en mayor sensibilidad de la detección.

El borrar occidental total, fluorescente se ha establecido como método robusto de detección de la proteína mientras que ofrece ventajas numerosas sobre métodos alternativos, tales como la capacidad de descubrir las proteínas múltiples simultáneamente, su alta sensibilidad, y procesos ahorradores de tiempo. El resultado es que se está convirtiendo en una técnica cada vez más popular para la detección de la proteína.

Fuentes:

  • Eaton, S., Roche, S., Llavero Hurtado, M., Oldknow, K., Farquharson, C., Gillingwater, T., y Wishart, T. (2013). Análisis de la proteína total como mando de cargamento seguro para borrar occidental fluorescente cuantitativo. PLoS UNO, 8(8), p.e72457. https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0072457
  • Jacksonimmuno.com. (2019). [en línea] disponible en: https://jacksonimmuno.com/secondary-antibody-resource/immuno-techniques/fluorescent-western-blotting/?pdf=126 [alcanzado el 17 de octubre de 2019].
  • Towbin, H., Staehelin, T., y Gordon, J. (1979). Transferencia electroforética de proteínas de los geles de poliacrilamida a las hojas de la nitrocelulosa: procedimiento y algunos usos. Procedimientos de la National Academy of Sciences, 76(9), pp.4350-4354. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/388439
  • Ni, D., Xu, P., y Gallagher, S. (2016). Immunoblotting e Immunodetection. Protocolos actuales en inmunología, 114(1), pp.8.10.1-8.10.36. https://currentprotocols.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/cpim.10

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Last Updated: Dec 12, 2019

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