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Quel est le Chromatographie-Ultra violet de liquide haute performance (HPLC-UV) ?

La chromatographie liquide haute performance (HPLC) est une technique employée pour séparer des molécules basées sur la charge de taille et extérieure, entre d'autres propriétés.  

La constitution de la spectroscopie ultraviolète (UV) avec la CLHP permet à la concentration des molécules d'être déterminée après séparation.

Par le monde ConnectCrédit d'image : Branchez le monde/Shutterstock

Chromatographie liquide haute performance (HPLC)

La CLHP a été précédemment nommée chromatographie liquide haute pression, distincte des méthodes à basse pression de chromatographie liquide, comme cette méthode se fonde sur la densité. Pressions de 50 - la barre 350 sont fréquemment utilisées pour réussir la phase mobile liquide par un fléau contenant la phase stationnaire solide.

Un fléau contenant le matériau absorbant, silice ou polymère en général granulaire, compose la phase stationnaire. La phase mobile se compose d'un mélange dissolvant liquide pressurisé, souvent l'eau, acétonitrile, et/ou méthylène. La phase mobile est choisie selon l'échantillon d'intérêt et la composition de la phase stationnaire.

Les molécules dans l'échantillon ont des degrés différents d'interaction avec le mobile et les phases stationnaires, qui détermine le degré de séparation réalisable entre eux.

chromatographie de Taille-exclusion

Des molécules dans un échantillon peuvent être séparées par taille pendant la CLHP. La phase stationnaire se compose des talons poreux de silice, que les petites molécules peuvent entrer dans, alors que de plus grandes molécules doivent circuler les talons et réussir par les espaces entre eux. Ceci permet à de plus grandes molécules de s'éluer plus rapidement que les plus petites, puisque de plus petites molécules deviennent collées dans les talons de silice pendant de plus longues périodes.

Cette méthode est employée souvent dans la détermination de poids moléculaire des protéines, des polysaccharides, ou des polymères, et peut être employée pour impliquer la structure tertiaire et quaternaire des protéines.

Chromatographie d'échange ionique

Des molécules dans un échantillon peuvent également être séparées ont basé sur leur attraction à la phase stationnaire. Une phase stationnaire de silice, par exemple, a exposé les atomes d'oxygène sur sa surface qui présentent une charge négative.

Des molécules dans un échantillon qui portent une charge négative sont évitées de gripper avec la phase stationnaire, et s'éluent ainsi plus rapidement.

Les conditions dissolvantes peuvent être changées une fois que les molécules non contraignantes ont réussi du fléau, détachant les molécules qui sont devenues attachées à la phase stationnaire et à leur permettre de s'éluer.

Cette technique est utilisée généralement en purification d'eau, chromatographie de ligand-échange, et chromatographie d'échange ionique.

chromatographie de Normal-phase

Les échantillons qui est promptement soluble dans les solvants non polaires et non aqueux tels que le chloroforme peuvent subir la chromatographie de normal-phase. Une phase stationnaire polaire est employée en plus des principes de taille-exclusion pour permettre la séparation des molécules basées sur ces propriétés.

Les facteurs stériques peuvent également jouer un rôle dans la période d'assemblage d'une molécule, et ainsi cette méthode est utilisée généralement pour séparer des isomères. Par exemple, les molécules avec deux groupes fonctionnels polaires à côté d'un des des autres les deux pourront agir l'un sur l'autre avec la phase stationnaire. Ceci a comme conséquence un temps de plus long assemblage qu'un isomère avec ses groupes polaires des bords opposés de la molécule, où les groupes fonctionnels ne peuvent pas agir l'un sur l'autre avec la phase stationnaire simultanément.

Chromatographie à phase renversée

Dans la CLHP à phase renversée, la phase stationnaire est non polaire, alors que la phase mobile liquide est la surface de phase stationnaire et est souvent enduite des réseaux alkyliques droits, signifiant que les molécules polaires éluent plus rapidement en raison des interactions hydrophobes, alors que les molécules hydrophiles ont un temps d'assemblage plus grand.

La chromatographie à phase renversée est la forme la plus courante de la CLHP, et est employée souvent dans l'industrie pharmaceutique aux fins du contrôle qualité.

Loi de Bière-Lambert

L'éclairage des molécules éluées avec la lumière UV permet à leur concentration d'être déterminée.

En prenant une concentration connue d'une molécule et d'une lumière UV brillante là-dessus et en mesurant l'intensité de la lumière absorbée et réfléchie aux longueurs d'onde spécifiques, une ligne zéro peut être réglée pour tenir compte du calcul de n'importe quelle concentration de cette molécule utilisant la loi de Bière-Lambert :

A = εbc

Là où A est l'absorbance mesurée par le détecteur à une longueur d'onde spécifique, le ε est l'absorptivité molaire de la molécule, b est la longueur de trajet par l'échantillon, et c est la concentration de l'échantillon.

La combinaison de la spectroscopie de CLHP et d'UV tient compte d'un mélange des molécules pour être séparée et leurs proportions de parent à déterminer par le calcul de leurs concentrations après l'élution du fléau de CLHP.

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Last Updated: Oct 31, 2018

Michael Greenwood

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Michael Greenwood

Michael graduated from Manchester Metropolitan University with a B.Sc. in Chemistry in 2014, where he majored in organic, inorganic, physical and analytical chemistry. He is currently completing a Ph.D. on the design and production of gold nanoparticles able to act as multimodal anticancer agents, being both drug delivery platforms and radiation dose enhancers.

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