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Que é o líquido de capacidade elevada Cromatografia-Ultravioleta (HPLC-UV)?

A cromatografia líquida de capacidade elevada (HPLC) é uma técnica usada para separar as moléculas baseadas no tamanho e na carga de superfície, entre outras propriedades.  

A incorporação da espectroscopia (UV) ultravioleta com HPLC permite que a concentração de moléculas seja determinada depois da separação.

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Cromatografia líquida de capacidade elevada (HPLC)

A HPLC foi nomeada previamente cromatografia líquida de alta pressão, distinta dos métodos de baixa pressão da cromatografia líquida, como este método confia na gravidade. Pressões de 50 - a barra 350 é empregada freqüentemente para passar a fase móvel líquida através de uma coluna que contem a fase estacionária contínua.

Uma coluna que contem o material absorvente, silicone ou polímero tipicamente granulado, compo a fase estacionária. A fase móvel consiste em uma mistura solvente líquida pressurizada, frequentemente água, acetonitrilo, e/ou metanol. A fase móvel é escolhida segundo a amostra de interesse e a composição da fase estacionária.

As moléculas dentro da amostra têm graus de deferimento de interacção com as fases móveis e estacionárias, que determina o grau de separação realizável entre elas.

cromatografia da Tamanho-exclusão

As moléculas dentro de uma amostra podem ser separadas pelo tamanho durante a HPLC. A fase estacionária é compo dos grânulos porosos do silicone, em que as moléculas pequenas podem entrar, quando as moléculas maiores deverem circundar os grânulos e os passar através dos espaços entre eles. Isto permite que as moléculas maiores elute mais rapidamente do que as menores, desde que as moléculas menores se tornam coladas dentro dos grânulos do silicone por uns períodos mais longos.

Este método é usado frequentemente na determinação do peso molecular das proteínas, dos polisacáridos, ou dos polímeros, e pode ser usado para pressupr a estrutura terciária e quaternário das proteínas.

Cromatografia da troca iónica

As moléculas dentro de uma amostra podem igualmente ser separadas basearam em sua atracção à fase estacionária. Uma fase estacionária do silicone, por exemplo, exps os átomos de oxigênio em sua superfície que apresentam uma carga negativa.

As moléculas dentro de uma amostra que carregam uma carga negativa são impedidas da ligação com a fase estacionária, e elute assim mais rapidamente.

As circunstâncias solventes podem ser moléculas uma vez não-obrigatórias mudadas passaram da coluna, destacando as moléculas que se tornaram encadernadas à fase estacionária e a permitir que elute.

Esta técnica é de uso geral na purificação de água, na cromatografia da ligante-troca, e na cromatografia da troca iónica.

cromatografia da Normal-fase

As amostras que é prontamente solúvel em solventes não-polares, não-aquosos tais como o clorofórmio podem submeter-se à cromatografia da normal-fase. Uma fase estacionária polar é usada além do que princípios da tamanho-exclusão para permitir a separação de moléculas baseadas nestas propriedades.

Os factores Steric podem igualmente jogar um papel na época de retenção de uma molécula, e assim que este método é de uso geral separar isómero. Por exemplo, as moléculas com dois grupos funcionais polares junto a um outras ambas poderão interagir com a fase estacionária. Isto conduz a uma estadia de retenção mais longa do que um isómero com seus grupos polares em lados opostos da molécula, onde os grupos funcionais são incapazes de interagir simultaneamente com a fase estacionária.

cromatografia da Inverter-fase

Na HPLC da inverter-fase, a fase estacionária é não-polar, quando a fase móvel líquida for a superfície da fase estacionária e é revestida frequentemente com as correntes rectas do alkyl, significando que as moléculas polares elute mais rapidamente devido às interacções hidrofóbicas, quando as moléculas hidrófilas tiverem uma estadia de retenção maior.

a cromatografia da Inverter-fase é o formulário o mais comum da HPLC, e é usada frequentemente na indústria farmacêutica para fins do controle da qualidade.

Lei de Cerveja-Lamberto

Iluminar moléculas eluted com luz UV permite que sua concentração seja determinada.

Tomando uma concentração conhecida de uma molécula e brilhando a luz UV nela e medindo a intensidade da luz absorvida e refletida em comprimentos de onda específicos, uma linha de base pode ser ajustada para permitir o cálculo de toda a concentração dessa molécula usando a lei de Cerveja-Lamberto:

A = εbc

Onde A é a absorvência medida pelo detector em um comprimento de onda específico, o ε é a absorvência do molar da molécula, b está a um comprimento de trajecto através da amostra, e c é a concentração da amostra.

Combinar a HPLC e a espectroscopia UV permite uma mistura das moléculas ser separada e suas proporções do parente a ser determinadas pelo cálculo de suas concentrações depois da eluição da coluna da HPLC.

Fontes:

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Last Updated: Oct 31, 2018

Michael Greenwood

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Michael Greenwood

Michael graduated from Manchester Metropolitan University with a B.Sc. in Chemistry in 2014, where he majored in organic, inorganic, physical and analytical chemistry. He is currently completing a Ph.D. on the design and production of gold nanoparticles able to act as multimodal anticancer agents, being both drug delivery platforms and radiation dose enhancers.

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