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¿Cuál es el líquido de alto rendimiento Cromatografía-Ultravioleta (HPLC-UV)?

La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) es una técnica usada para separar las moléculas basadas en talla y la carga superficial, entre otras propiedades.  

La incorporación de la espectroscopia (UV) ultravioleta con CLAR permite que la concentración de moléculas sea determinada después de la separación.

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Cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)

La CLAR previamente fue nombrada cromatografía líquida de alta presión, distinta de los métodos de baja presión de la cromatografía líquida, como este método confía en gravedad. Presiones de 50 - la barra 350 se emplea con frecuencia para pasar la fase movible líquida a través de una olumna que contiene la fase estacionaria sólida.

Una olumna que contiene el material absorbente, sílice o polímero típicamente granular, compone la fase estacionaria. La fase movible consiste en una mezcla solvente líquida a presión, a menudo agua, acetonitrilo, y/o metanol. La fase movible se elige dependiendo de la muestra del interés y de la composición de la fase estacionaria.

Las moléculas dentro de la muestra tienen grados que difieren de acción recíproca con las fases movibles y estacionarias, que determina el grado de separación realizable entre ellas.

cromatografía de la Talla-exclusión

Las moléculas dentro de una muestra se pueden separar por talla durante CLAR. La fase estacionaria se compone de las molduras porosas del sílice, que las pequeñas moléculas pueden entrar en, mientras que moléculas más grandes deben circundar las molduras y pasar a través de los espacios entre ellos. Esto permite que moléculas más grandes se enjuaguen más rápidamente que las más pequeñas, puesto que moléculas más pequeñas se adhieren dentro de las molduras del sílice por períodos más largos.

Este método es de uso frecuente en la determinación del peso molecular de proteínas, de polisacáridos, o de polímeros, y se puede utilizar para deducir la estructura terciaria y de cuaternario de proteínas.

Cromatografía de intercambio iónico

Las moléculas dentro de una muestra se pueden también separar basaron en su atracción a la fase estacionaria. Una fase estacionaria del sílice, por ejemplo, ha expuesto los átomos de oxígeno en su superficie que presentan una carga negativa.

Las moléculas dentro de una muestra que soportan una carga negativa se previenen de atar con la fase estacionaria, y se enjuagan así más rápidamente.

Las condiciones solventes pueden ser moléculas una vez no-obligatorias cambiadas han pasado de la olumna, destacando las moléculas que han llegado a estar encuadernadas a la fase estacionaria y a permitir que se enjuaguen.

Esta técnica es de uso general en la purificación del agua, la cromatografía de la ligand-cantina, y la cromatografía de intercambio iónico.

cromatografía de la Normal-fase

Las muestras que es fácilmente soluble en disolventes no polares, no acuosos tales como cloroformo pueden experimentar la cromatografía de la normal-fase. Una fase estacionaria polar se utiliza además de principios de la talla-exclusión para permitir la separación de moléculas basadas en estas propiedades.

Los factores estéricos pueden también desempeñar un papel en la época de retención de una molécula, y así que este método es de uso general separar los isómeros. Por ejemplo, las moléculas con dos grupos funcionales polares adyacente a uno otras ambas podrán obrar recíprocamente con la fase estacionaria. Esto da lugar a un rato de una retención más larga que un isómero con sus grupos polares en los lados opuestos de la molécula, donde están incapaces los grupos funcionales de obrar recíprocamente con la fase estacionaria simultáneamente.

Cromatografía inversa

En la CLAR inversa, la fase estacionaria es no polar, mientras que la fase movible líquida es la superficie de la fase estacionaria y está recubierta a menudo con las cadenas alkílicas derechas, significando que las moléculas polares enjuagan más rápidamente debido a las acciones recíprocas hidrofóbicas, mientras que las moléculas hidrofílicas tienen un mayor rato de retención.

La cromatografía inversa es la forma más común de la CLAR, y es de uso frecuente en la industria farmacéutica con el propósito de control de calidad.

Ley de Cerveza-Lamberto

La iluminación de las moléculas enjuagadas con la luz UV permite que su concentración sea determinada.

Tomando una concentración sabida de una molécula y de una luz UV brillante en ella y midiendo la intensidad de la luz absorbente y reflejada en las longitudes de onda específicas, una línea de fondo se puede fijar para tener en cuenta el cálculo de cualquier concentración de esa molécula usando la ley de Cerveza-Lamberto:

A = εbc

Donde está la absorción A medida por el detector en una longitud de onda específica, el ε es la absorbencia molar de la molécula, b es el largo de camino a través de la muestra, y c es la concentración de la muestra.

Combinar CLAR y la espectroscopia ULTRAVIOLETA permite una mezcla de moléculas ser separada y sus proporciones del pariente que se determinarán por el cálculo de sus concentraciones después de la elución de la olumna de la CLAR.

Fuentes:

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Last Updated: Oct 31, 2018

Michael Greenwood

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Michael Greenwood

Michael graduated from Manchester Metropolitan University with a B.Sc. in Chemistry in 2014, where he majored in organic, inorganic, physical and analytical chemistry. He is currently completing a Ph.D. on the design and production of gold nanoparticles able to act as multimodal anticancer agents, being both drug delivery platforms and radiation dose enhancers.

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