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Quel est ACP de Méthylation-Détail ?

L'ACP de détail de méthylation (amplification en chaîne par polymérase) est employé pour trouver des gènes ou des séquences avec la méthylation d'ADN.

Importance de trouver la méthylation d'ADN

La méthylation d'ADN est un procédé épigénétique important qui a de divers rôles pour régler l'expression du gène, les gènes imprimés, l'inactivation des chromosomes de X, et le dysregulation de ces configurations dans les maladies. Indépendamment des nucléotides, les protéines et les lipides obtiennent également méthylés. Pendant la réplication de l'ADN, un groupe méthylique est ajouté sur la sonnerie de pyrimidine de la cytosine sur la position 5 (5-methylcytosine) dans la méthylation (cytosines de CpG). Ce procédé est assisté par des méthyltransférases d'ADN.

Méthodes pour trouver la méthylation d'ADN

Indépendamment de l'ACP de méthylation-détail, une autre méthode pour trouver la méthylation comprend l'hybridation du sud avec des endonucléases méthylation-sensibles. Dans cette méthode, un détail d'endonucléase à la méthylation assimile l'ADN génomique. Par la suite, il electrophorized sur un gel d'agarose et une sonde ADN spécifique est utilisée. L'endonucléase dans ce cas fendra l'ADN si les cytosines sont méthylation libre. Ainsi, les régions qui sont méthylées demeurent uncleaved et apparaissent en tant que grandes bandes sur le gel. Cependant, cette méthode exige un grand nombre d'ADN pour chaque analyse. En outre, seulement les cytosines pour lequel des endonucléases de méthylation-détail sont procurables peut être examiné.

Concept d'ACP de détail de méthylation

Dans cette méthode, deux amorces spécifiques de méthylation sont utilisées : une amorce unmethylated et une amorce méthylée. L'amorce unmethylated amplifie le sodium ADN converti par bisulfite qui est présent dans l'ADN unmethylated, alors que l'amorce méthylée amplifie le sodium ADN méthylé converti par bisulfite.

Traitement de bisulfite de sodium

L'ADN est soumis aux réactions chimiques de convertir la cytosine en uracile et de réaliser la dégradation limitée de l'ADN. Pour ceci, l'ADN est traité avec du bisulfite de sodium pendant 16 heures à 50 °C. La quantité d'ADN ne devrait pas être augmentée pendant qu'elle peut mener à la conversion et à la présence inachevées des faux positifs. Après demande de règlement avec du bisulfite de sodium, l'ADN existe comme monocaténaire et est extrêmement sensible pour la dégradation. Cet ADN devrait être enregistré au °C -20 pour éviter la dégradation et la fragmentation.

Modèle d'amorce

Pour distinguer entre l'ADN de façon optimale méthylé et unmethylated, les amorces devraient avoir trois nucléotides de CpG dans le 3' segment de l'amorce.  Les amorces devraient avoir de cytosines un grand nombre un non-CpG dans la matrice.  La longueur des amorces devrait être au moins le point d'ébullition 23-24 pour obtenir l'adoucissement spécifique de l'amorce. Pour réaliser de bons résultats, le produit qui doit être amplifié ne devrait pas être plus grand que le point d'ébullition 150.

États d'ACP

le Bêta-mercaptoéthanol devrait être employé pour amplifier l'ADN riche en chromatographie. La température d'adoucissement des amorces est critique. La température correcte devrait être déterminée empiriquement en examinant plusieurs températures d'adoucissement. Bien que le nombre typique de cycles d'amplification devrait être environ 25 cycles, le nombre spécifique de cycles d'amplification doit être déterminé pour chaque réaction de MSP.  Dans chaque expérience, le positif, le négatif, et les contrôles de l'eau devraient être inclus. Après l'opération d'amplification, 6−8% électrophorèse en gel nondenatured de polyacrylamide peut être exécuté pour concevoir les produits amplifiés.

Applications de MSP

Le multiplex a emboîté MSP

Pour augmenter la sensibilité de MSP pour trouver l'ADN méthylé, un MSP emboîté et à deux étages a été développé. Dans cette méthode, un premier rond d'ACP est exécuté pour amplifier le sodium ADN modifié par bisulfite. Le produit d'ACP obtenu après le premier cycle est encore le pli 50−100 dilué. Alors l'échantillon est soumis à un deuxième rond des réactions d'ACP. MSP emboîté est plus sensible et peut trouver la méthylation même dans les échantillons qui ont la qualité faible d'ADN.

MSP quantitatif

Plusieurs méthodes quantitatives ont été développées pour mesurer le niveau de la méthylation dans l'ADN. MSP quantitatif ne comprend pas des opérations complémentaires ou l'électrophorèse en gel d'ACP effectuant à ceci une méthode plus rapide pour examiner l'ADN méthylé. Cette technique est également employée pour trouver des aberrations dans la méthylation de diffuser l'ADN en sérum des malades du cancer.

MSP in situ

Car les autres méthodes de MSP ne peuvent pas trouver des modifications pendant les stades de développement spécifiques, les chercheurs ont combiné l'hybridation in situ avec MSP pour le dépistage in situ de l'ADN méthylé. Dans cette méthode, des parties de tissu sont traitées avec du bisulfite de sodium et l'analyse de MSP est faite. L'hybridation in situ est exécutée sur les échantillons après l'opération d'amplification pour produire des résultats in situ de MSP.

Sources

Further Reading

Last Updated: Sep 17, 2018

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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