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Che cosa è PCR Metilazione-Specifica?

La PCR specifica di metilazione (reazione a catena della polimerasi) è usata per individuare i geni o le sequenze con metilazione del DNA.

Importanza di rilevazione della metilazione del DNA

La metilazione del DNA è un trattamento epigenetico importante che ha diversi ruoli per regolamentare l'espressione genica, i geni impressi, l'inattivazione dei cromosomi X e il dysregulation di questi reticoli nelle malattie. Oltre ai nucleotidi, le proteine ed i lipidi egualmente ottengono metilati. Durante il replicazione del dna, un gruppo metilico si aggiunge sull'anello della pirimidina di citosina 5 sulla posizione (5-methylcytosine) nella metilazione (cytosines di CpG). Questo trattamento è mediato dai methyltransferases del DNA.

Metodi per individuare metilazione del DNA

Oltre alla PCR metilazione-specifica, un altro metodo per individuare la metilazione comprende l'ibridazione del sud con agli gli endonucleasi metilazione sensibili. In questo metodo, un endonucleasi specifico a metilazione digerisce il DNA genomico. Successivamente, electrophorized su un gel di agarosio e una sonda specifica del DNA è usata. L'endonucleasi in questo caso fenderà il DNA se i cytosines sono metilazione libera. Quindi, le regioni che sono metilate rimangono uncleaved e compaiono come grandi bande sul gel. Tuttavia, questo metodo richiede un gran numero di DNA per ogni analisi. Inoltre, soltanto i cytosines per cui endonucleasi metilazione-specifici sono disponibili può essere esaminato.

Concetto della PCR specifica di metilazione

In questo metodo, due mani di fondo specifiche di metilazione sono utilizzate: una mano di fondo unmethylated e una mano di fondo metilata. La mano di fondo unmethylated amplia il DNA convertito bisolfuro del sodio che è presente in DNA unmethylated, mentre la mano di fondo metilata amplia il DNA metilato convertito sodio bisolfito.

Trattamento del sodio bisolfito

Il DNA è sottoposto alle reazioni chimiche alla citosina del convertito ad uracile e raggiungere la degradazione limitata di DNA. Per questo, il DNA è trattato con il bisolfuro del sodio per 16 ore a 50 °C. La quantità di DNA non dovrebbe essere aumentata mentre può piombo alla conversione ed alla presenza incomplete di falsi positivi. Dopo il trattamento con il bisolfuro del sodio, il DNA esiste come singolo filo ed è altamente sensibile per degradazione. Questo DNA dovrebbe essere memorizzato a °C -20 per evitare la degradazione e la frammentazione.

Progettazione della mano di fondo

Per discriminare fra il DNA ottimamente metilato e unmethylated, le mani di fondo dovrebbero avere tre nucleotidi di CpG nel 3' segmento della mano di fondo.  Le mani di fondo dovrebbero avere tantissimi cytosines di non CPG nel modello.  La lunghezza delle mani di fondo dovrebbe essere almeno 23-24 B.P. per ottenere la ricottura specifica della mano di fondo. Per raggiungere i buoni risultati, il prodotto che deve essere ampliato non dovrebbe essere più grande di 150 B.P.

Stati di PCR

il Beta-mercaptoetanolo dovrebbe essere usato per ampliare del il DNA ricco di gascromatografia. La temperatura di ricottura delle mani di fondo è critica. La temperatura corretta dovrebbe essere determinata empiricamente mediante l'esame delle parecchie temperature di ricottura. Sebbene il numero tipico dei cicli di amplificazione dovrebbe essere di intorno 25 cicli, il numero specifico dei cicli dell'amplificazione deve essere risoluto per ogni reazione di MSP.  In ogni esperimento, il positivo, la quantità negativa ed i controlli delle acque dovrebbero essere inclusi. Dopo il punto di amplificazione, 6−8% l'elettroforesi nondenatured del gel di poliacrilammide può essere eseguito per visualizzare i prodotti ampliati.

Applicazioni di MSP

La multisala ha intercalato MSP

Per l'aumento della sensibilità di MSP per individuare il DNA metilato, un MSP intercalato e a due stadi è stato sviluppato. In questo metodo, un primo giro della PCR è eseguito per ampliare il DNA modificato sodio bisolfito. Il prodotto di PCR ottenuto dopo il primo ciclo è più ancora popolare diluito 50−100. Poi il campione è sottoposto ad un secondo giro delle reazioni di PCR. MSP intercalato è più sensibile e può individuare la metilazione anche in campioni che hanno qualità difficile del DNA.

MSP quantitativo

Parecchi metodi quantitativi sono stati messi a punto per quantificare il livello di metilazione nel DNA. MSP quantitativo non comprende i punti di PCR o l'elettroforesi supplementari del gel che rendono questo un metodo più veloce per schermare il DNA metilato. Questa tecnica egualmente è usata per individuare le aberrazioni nella metilazione di fare circolare il DNA in siero dei malati di cancro.

MSP in situ

Poichè gli altri metodi di MSP non possono individuare i cambiamenti durante le fasi specifiche dello sviluppo, i ricercatori hanno combinato l'ibridazione in situ con MSP per rilevazione in situ di DNA metilato. In questo metodo, le sezioni del tessuto sono trattate con il bisolfuro del sodio e l'analisi di MSP è fatta. L'ibridazione in situ è realizzata sui campioni dopo il punto di amplificazione per generare i risultati in situ di MSP.

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Last Updated: Sep 17, 2018

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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