Aviso: Esta página é uma tradução automática da página original em inglês. Por favor note uma vez que as traduções são geradas por máquinas, não tradução tudo será perfeita. Este site e suas páginas da Web destinam-se a ler em inglês. Qualquer tradução deste site e suas páginas da Web pode ser imprecisas e imprecisos no todo ou em parte. Esta tradução é fornecida como uma conveniência.

Que é PCR Methylation-Específico?

O PCR específico do Methylation (reacção em cadeia da polimerase) é usado para detectar genes ou seqüências com methylation do ADN.

Importância de detectar o Methylation do ADN

O methylation do ADN é um processo epigenético importante que tenha os papéis diversos para regular a expressão genética, genes imprimidos, inactivação de cromossomas de X, e o dysregulation destes testes padrões nas doenças. Independentemente dos nucleotides, as proteínas e os lipidos igualmente obtêm misturados. Durante a réplica do ADN, um grupo metílico é adicionado no anel da pirimidina do cytosine na posição 5 (5-methylcytosine) no methylation (cytosines de CpG). Este processo é negociado por methyltransferases do ADN.

Métodos para detectar o Methylation do ADN

Independentemente do PCR methylation-específico, um outro método para detectar o methylation inclui a hibridação do sul com endonucleases methylation-sensíveis. Neste método, um específico do endonuclease ao methylation digere o ADN genomic. Subseqüentemente, electrophorized em um gel do agarose e uma ponta de prova específica do ADN é usada. O endonuclease neste caso fenderá o ADN se os cytosines são methylation livre. Assim, as regiões que são misturadas permanecem uncleaved e aparecem como grandes faixas no gel. Contudo, este método exige grandes quantidades de ADN para cada análise. Também, somente os cytosines para que endonucleases methylation-específicos estão disponíveis pode ser examinado.

Conceito do PCR específico do Methylation

Neste método, duas primeiras demão específicas do methylation são usadas: uma primeira demão unmethylated e uma primeira demão misturada. A primeira demão unmethylated amplifica o ADN convertido bissulfito do sódio que esta presente no ADN unmethylated, visto que a primeira demão misturada amplifica o ADN misturado convertido bissulfito do sódio.

Tratamento do bissulfito do sódio

O ADN é sujeitado às reacções químicas converter o cytosine ao uracil e conseguir degradação limitada do ADN. Para isto, o ADN é tratado com o bissulfito do sódio por 16 horas em 50 °C. A quantidade de ADN não deve ser aumentada enquanto pode conduzir à conversão e à presença incompletas de falsos positivos. Após o tratamento com bissulfito do sódio, o ADN existe como a única costa e é altamente sensível para a degradação. Este ADN deve ser armazenado no °C -20 para evitar a degradação e a fragmentação.

Projecto da primeira demão

Para discriminar entre o ADN óptima misturado e unmethylated, as primeiras demão devem ter três nucleotides de CpG no 3' segmento da primeira demão.  As primeiras demão devem ter um grande número cytosines de não-CPG no molde.  O comprimento das primeiras demão deve ser pelo menos 23-24 bp para obter o recozimento específico da primeira demão. Para conseguir bons resultados, o produto que tem que ser amplificado não deve ser maior de 150 bp.

Condições do PCR

o Beta-mercaptoethanol deve ser usado para amplificar o ADN GC-rico. A temperatura do recozimento das primeiras demão é crítica. A temperatura correcta deve ser determinada empìrica examinando diversas temperaturas do recozimento. Embora o número típico de ciclos da amplificação deva ser ao redor 25 ciclos, o número específico de ciclos da amplificação tem que ser determinado para cada reacção de MSP.  Em cada experiência, o positivo, o negativo, e os controles da água devem ser incluídos. Após a etapa da amplificação, 6−8% electroforese nondenatured do gel de polyacrylamide pode ser executado para visualizar os produtos amplificados.

Aplicações de MSP

O multiplex aninhou MSP

Para aumentar a sensibilidade de MSP para detectar o ADN misturado, um MSP aninhado, de duas fases foi desenvolvido. Neste método, um primeiro círculo do PCR é executado para amplificar o ADN alterado bissulfito do sódio. O produto do PCR obtido após o primeiro ciclo é mais a dobra 50−100 diluída. A amostra é sujeitada então a um segundo círculo de reacções do PCR. MSP aninhado é mais sensível e pode detectar o methylation mesmo nas amostras que têm a qualidade deficiente do ADN.

MSP quantitativo

Diversos métodos quantitativos foram desenvolvidos para determinar o nível de methylation no ADN. MSP quantitativo não inclui as etapas do PCR ou a electroforese adicional do gel que fazem a isto um método mais rápido para seleccionar o ADN misturado. Esta técnica é usada igualmente para detectar aberrações no methylation de circular o ADN no soro das pacientes que sofre de cancro.

MSP in situ

Porque os outros métodos de MSP não podem detectar mudanças durante fases específicas da revelação, os pesquisadores combinaram a hibridação in situ com o MSP para a detecção in situ de ADN misturado. Neste método, as secções do tecido são tratadas com o bissulfito do sódio e a análise de MSP é feita. A hibridação in situ é executada nas amostras após a etapa da amplificação para gerar resultados in situ de MSP.

Fontes

Further Reading

Last Updated: Sep 17, 2018

Dr. Surat P

Written by

Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

Citations

Please use one of the following formats to cite this article in your essay, paper or report:

  • APA

    P, Surat. (2018, September 17). Que é PCR Methylation-Específico?. News-Medical. Retrieved on September 27, 2020 from https://www.news-medical.net/life-sciences/What-is-Methylation-Specific-PCR.aspx.

  • MLA

    P, Surat. "Que é PCR Methylation-Específico?". News-Medical. 27 September 2020. <https://www.news-medical.net/life-sciences/What-is-Methylation-Specific-PCR.aspx>.

  • Chicago

    P, Surat. "Que é PCR Methylation-Específico?". News-Medical. https://www.news-medical.net/life-sciences/What-is-Methylation-Specific-PCR.aspx. (accessed September 27, 2020).

  • Harvard

    P, Surat. 2018. Que é PCR Methylation-Específico?. News-Medical, viewed 27 September 2020, https://www.news-medical.net/life-sciences/What-is-Methylation-Specific-PCR.aspx.

Comments

The opinions expressed here are the views of the writer and do not necessarily reflect the views and opinions of News Medical.