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¿Cuál es polimerización en cadena Metilación-Específica?

La polimerización en cadena específica de la metilación (reacción en cadena de polimerasa) se utiliza para descubrir genes o series con la metilación de la DNA.

Importancia de descubrir la metilación de la DNA

La metilación de la DNA es un proceso epigenético importante que tiene papeles diversos para regular la expresión génica, genes impresos, la desactivación de los cromosomas de X, y el dysregulation de estas configuraciones en enfermedades. Aparte de los nucleótidos, las proteínas y los lípidos también consiguen desnaturalizados. Durante la réplica de la DNA, agregan a un grupo metílico en el anillo de la pirimidina de la citosina en la posición 5 (5-methylcytosine) en la metilación (cytosines de CpG). Este proceso es mediado por methyltransferases de la DNA.

Métodos para descubrir la metilación de la DNA

Aparte de la polimerización en cadena metilación-específica, otro método para descubrir la metilación incluye el hibridación meridional con los endonucleases metilación-sensibles. En este método, un específico del endonuclease a la metilación digiere la DNA genomic. Posteriormente, electrophorized en un gel de la agarosa y se utiliza una antena específica de la DNA. El endonuclease en este caso henderá la DNA si los cytosines son metilación libre. Así, las regiones se desnaturalizan que siguen uncleaved y aparecen como bandas grandes en el gel. Sin embargo, este método requiere una gran cantidad de DNA para cada análisis. También, solamente los cytosines para que los endonucleases metilación-específicos están disponibles puede ser examinado.

Concepto de polimerización en cadena específica de la metilación

En este método, se utilizan dos pinturas de fondo específicas de la metilación: una pintura de fondo unmethylated y una pintura de fondo desnaturalizada. La pintura de fondo unmethylated amplifica la DNA convertida bisulfito del sodio que está presente en la DNA unmethylated, mientras que la pintura de fondo desnaturalizada amplifica la DNA desnaturalizada convertida bisulfito del sodio.

Tratamiento del bisulfito del sodio

La DNA se sujeta a las reacciones químicas a la citosina del convertido al uracilo y lograr la degradación limitada de la DNA. Para esto, la DNA se trata con el bisulfito del sodio por 16 horas en 50 °C. La cantidad de DNA no debe ser aumentada mientras que puede llevar a la conversión y a la presencia incompletas de positivos falsos. Después del tratamiento con bisulfito del sodio, la DNA existe como único cabo y es altamente sensible para la degradación. Esta DNA se debe salvar en el °C -20 para evitar la degradación y la fragmentación.

Diseño de la pintura de fondo

Para discriminar entre óptimo desnaturalizada y unmethylated la DNA, las pinturas de fondo deben tener tres nucleótidos de CpG en el 3' segmento de la pintura de fondo.  Las pinturas de fondo deben tener un gran número de cytosines de no-CPG en el patrón.  El largo de pinturas de fondo debe ser por lo menos el punto de ebullición 23-24 para conseguir la esmaltación específica de la pintura de fondo. Para lograr buenos resultados, el producto que tiene que ser amplificado no debe ser más grande del punto de ebullición 150.

Condiciones de la polimerización en cadena

el Beta-mercaptoetanol se debe utilizar para amplificar la DNA Cromatografía-rica. La temperatura de la esmaltación de las pinturas de fondo es crítica. La temperatura correcta debe ser determinada empírico examinando varias temperaturas de la esmaltación. Aunque el número típico de ciclos de la amplificación deba ser alrededor 25 ciclos, el número específico de ciclos de la amplificación tiene que ser resuelto para cada reacción de MSP.  En cada experimento, el positivo, la negativa, y los mandos del agua deben ser incluidos. Después del paso de la amplificación, el 6−8% electroforesis nondenatured del gel de poliacrilamida se pueden realizar para visualizar los productos amplificados.

Usos de MSP

El múltiplex jerarquizó MSP

Para aumentar la sensibilidad de MSP para descubrir la DNA desnaturalizada, un MSP jerarquizado, de dos etapas fue desarrollado. En este método, un primer cartucho de la polimerización en cadena se realiza para amplificar la DNA modificada bisulfito del sodio. El producto de la polimerización en cadena obtenido después del primer ciclo es más a fondo el doblez diluido 50−100. Entonces la muestra se sujeta a un segundo cartucho de las reacciones de la polimerización en cadena. MSP jerarquizado es más sensible y puede descubrir la metilación incluso en las muestras que tienen calidad pobre de la DNA.

MSP cuantitativo

Varios métodos cuantitativos se han desarrollado para cuantificar el nivel de metilación en la DNA. MSP cuantitativo no incluye los pasos de la polimerización en cadena o la electroforesis adicionales del gel que hacen esto un método más rápido para revisar la DNA desnaturalizada. Esta técnica también se utiliza para descubrir aberraciones en la metilación de circular la DNA en el suero de enfermos de cáncer.

MSP in situ

Pues los otros métodos de MSP no pueden descubrir cambios durante escenarios específicos del revelado, los investigadores han combinado el hibridación in situ con MSP para la detección in situ de la DNA desnaturalizada. En este método, las secciones del tejido se tratan con bisulfito del sodio y se hace el análisis de MSP. El hibridación in situ se realiza en las muestras después del paso de la amplificación para generar resultados ines situ de MSP.

Fuentes

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Last Updated: Sep 17, 2018

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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