Le fractionnement mitochondrial peut être employé pour obtenir les fractions mitochondriales d'isolement des cellules vivantes.
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Ces fractions sont des échantillons de matériau mitochondrial concentré qui peuvent être employés pour étudier les procédés biochimiques des mitochondries dans l'échantillon. Le fractionnement mitochondrial peut être employé pour la recherche ou l'usage diagnostique.
L'analyse est employée pour vérifier des voies d'apoptotique et de transduction du signal. Les fractions séparées qu'elle produit peuvent également plus plus loin être vérifiées par Western blotting, ELISA, ou d'autres analyses, pour découvrir la translocation des facteurs entre deux fractions.
La base de la méthode elle-même concerne décomposer un échantillon de cultures cellulaires, mécaniquement ou chimiquement, et puis séparant la fraction mitochondriale de l'autre matériau de cellules par l'intermédiaire de la centrifugation.
C'est devenu une méthode ferme déterminée dans les laboratoires biologiques dus à sa robustesse, simplicité, et simplicité d'utilisation, et cela il n'exige aucune ultra-centrifugation ou produit chimique toxique.
Protocole d'analyse
Il y a plusieurs étapes au protocole normal pour conduire le fractionnement mitochondrial. La première étape concerne rassembler l'échantillon de cellules par centrifugation, les laver, et les resuspendre d'un tampon contenant DTT et inhibiteurs de la protéase.
Après une brève période d'incubation sur la glace, les cellules peuvent alors être homogénéisées utilisant une broyeur de tissu, le rendement dont devrait être vérifié par l'observation de la suspension homogénéisée sous un microscope.
L'homogénéisation excessive devrait être évitée pour éviter les dégâts à la membrane mitochondriale. Après cette opération, l'homogénat peut être transféré dans un tube de microcentrifuge et être centrifugé de nouveau.
Puis, le surnageant est rassemblé et transféré dans un tube frais et centrifugé de nouveau. Les boulettes de la deuxième centrifugeuse devraient être enrégistrées et resuspendues si des mitochondries intactes sont exigées.
Les laboratoires variés fabriquent les analyses mitochondriales de fractionnement qui varieront légèrement dans leur protocole, cependant, la méthode concerne toujours utilisant des centrifugeuses pour séparer des mitochondries des cultures cellulaires qui ont été décomposées chimiquement ou mécaniquement.
Pourquoi fractions mitochondriales d'étude
L'étude des mitochondries est indispensable à de nombreux endroits de biologie. Puisque les organelles sont responsables d'un grand choix de rôles essentiels, tels que le métabolisme acide aminé, le métabolisme d'hydrates de carbone, l'oxydation des acides gras, la mort cellulaire programmée (apoptose), la formation de radical libre, la transduction du signal, ainsi que les gènes d'hôte codant plusieurs protéines importantes.
Vérifier et étudier des mitochondries est pour cette raison connaissance de base à la connaissance se développante autour de fonctionnement de cellules, ainsi que pour élever une compréhension des troubles mitochondriaux et des réactions mitochondriales aux agents pharmacologiques.
Le fonctionnement mitochondrial défectueux peut mener aux troubles mitochondriaux et est également joint avec les maladies variées, rendant les fractions mitochondriales précieuses au développement et contrôle de l'intervention thérapeutique neuve.
Les fractions mitochondriales sont la passerelle à comprendre l'activité des mitochondries parce que des méthodes qui emploient l'organisme entier ou les extractions entières de tissu peuvent être gênées en produisant des caractéristiques fiables et précises de métabolisme mitochondrial à cause de la perturbation provoquée par la présence d'autres métabolites cytosoliques.
Le rôle des mitochondries dans la maladie
L'activité des mitochondries a été jointe avec plusieurs maladies, pour cette raison, l'étude de elles est significative en élevant une compréhension du développement et de l'étape progressive de la maladie, et même au développement des demandes de règlement neuves.
Des mutations mitochondriales d'ADN (ADNmt) ont été déjà jointes avec les mitochondriopathies neuromusculaires et neurodegenerative, le diabète, les maladies cardio-vasculaires, les troubles gastro-intestinaux, les affections cutanées, le vieillissement, et le cancer.
Par exemple, un nombre de plus en plus important des études explorent le rôle des mitochondries dans le cancer. Les mutations dans l'ADNmt ont été rapportées dans l'adénocarcinome rénal, les cellules de cancer du côlon, les tumeurs de tête et de col, les tumeurs astrocytic, les tumeurs thyroïde, les tumeurs du sein, les tumeurs ovariennes, la prostate et le cancer de la vessie, les neuroblastomas et les oncocytomas.
Des mutations dans ADN nucléaire (nDNA) se sont avérées pour affecter indirectement l'ADNmt, et ont été également jointes avec les cancers spécifiques.
En outre, l'activité mitochondriale est connue pour être essentielle à mettre à jour le fonctionnement correcte des tissus et des organes qui se fondent sur les niveaux élevés et cohérents de l'énergie, tels que le coeur. Des bruits aux mitochondries ont été pour cette raison joints avec la maladie cardio-vasculaire (CVD), et l'utilisation de la fraction mitochondriale est employée dans les études pour vérifier cette tige et pour élucider le plein rôle des mitochondries dans la CVD.
Aussi bien qu'être impliquée dans maladies variées, il y a un groupe spécifique de troubles hérités qui sont classifiés par la défaillance des mitochondries de produire assez d'énergie pour permettre au fuselage de fonctionner correctement.
Celles-ci désigné sous le nom des Maladies mitochondriales. Elles peuvent affecter n'importe quelle partie du fuselage, des cellules du cerveau et des nerfs aux muscles, au coeur, au foie, aux reins, au pancréas et même aux yeux et aux oreilles. Tandis que ces maladies sont rares, environ 1.000 à 4.000 enfants sont nés aux USA tous les ans avec la maladie, qui peut être fatale, et pour ce qui là n'est aucun remède connu.
Par conséquent, l'utilisation du fractionnement mitochondrial d'étudier le comportement des mitochondries dans ces maladies est essentielle à l'enquête prolongée sur les traitements potentiels neufs qui pourraient améliorer la qualité de vie et éviter des morts.
Résumé
Le fractionnement mitochondrial est une méthode indispensable pour séparer des cultures des mitochondries des échantillons de cellules afin de les étudier. Cette technique a inestimable prouvé à élever une compréhension du fonctionnement des mitochondries et de leur rôle dans un certain nombre de maladies, ainsi qu'à l'aide pour développer des traitements neufs potentiels pour la maladie.
Sources
- Chistiakov, D., Shkurat, T., Melnichenko, A., Grechko, A. et Orekhov, A. (2017). Le rôle du dysfonctionnement mitochondrial dans la maladie cardio-vasculaire : une brève révision. Annales du médicament, 50(2), pp.121-127. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29237304
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