O fraccionamento mitocondrial pode ser usado para obter fracções mitocondriais isoladas das pilhas vivas.
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Estas fracções são as amostras de material mitocondrial concentrado que podem ser usadas para estudar os processos bioquímicos das mitocôndria na amostra. O fraccionamento mitocondrial pode ser usado para a pesquisa ou o uso diagnóstico.
O ensaio é usado para investigar caminhos apoptotic e do sinal da transdução. As fracções que separadas produz podem igualmente mais ser investigadas pela mancha ocidental, pelo ELISA, ou pelos outros ensaios, para descobrir a translocação dos factores entre duas fracções.
A base do método própria envolve dividir uma amostra de culturas celulares, mecanicamente ou quimicamente, e então separando a fracção mitocondrial do outro material da pilha através da centrifugação.
Transformou-se um método firme estabelecido nos laboratórios biológicos devido a seus vigor, simplicidade, e acessibilidade, e isso não exige nenhum ultra-centrifugação ou produto químico tóxico.
Protocolo do ensaio
Há diversas fases ao protocolo padrão para conduzir o fraccionamento mitocondrial. A primeira etapa envolve recolher a amostra da pilha pela centrifugação, lavá-los, e resuspending os com um amortecedor que contem DTT e inibidores de Protease.
Após um breve período de incubação no gelo, as pilhas podem então ser homogeneizadas usando um moedor do tecido, a eficiência de que deve ser verificado pela observação da suspensão homogeneizada sob um microscópio.
A homogeneização excessiva deve ser evitada para impedir dano à membrana mitocondrial. Depois desta etapa, o homogenate pode ser transferido em uma câmara de ar do microcentrifuge e ser centrifugado outra vez.
Então, o supernatant é recolhido e transferido em uma câmara de ar fresca e centrifugado outra vez. As pelotas do segundo centrifugador devem ser salvar e resuspended se as mitocôndria intactos sãas.
Os vários laboratórios fabricado os ensaios mitocondriais do fraccionamento que variarão ligeira em seu protocolo, contudo, o método envolve sempre usar centrifugadores para separar as mitocôndria das culturas celulares que foram divididas quimicamente ou mecanicamente.
Porque fracções mitocondriais do estudo
O estudo das mitocôndria é vital às áreas numerosas da biologia. Porque os organelles são responsáveis para uma variedade de funções essenciais, tais como o metabolismo do ácido aminado, o metabolismo de hidrato de carbono, a oxidação do ácido gordo, a morte celular programada (apoptosis), a formação radical livre, a transdução do sinal, assim como os genes do anfitrião que codificam diversas proteínas importantes.
Investigar e estudar as mitocôndria são conseqüentemente fundamento ao conhecimento tornando-se em torno da função da pilha, assim como para crescer uma compreensão de desordens mitocondriais e de respostas mitocondriais aos agentes farmacológicos.
A função mitocondrial defeituosa pode conduzir às desordens mitocondriais e é ligada igualmente com as várias doenças, fazendo fracções mitocondriais valiosas à revelação e ao teste de intervenções terapêuticas novas.
As fracções mitocondriais são o Gateway a compreender a actividade das mitocôndria porque os métodos que usam o organismo inteiro ou extracções inteiras do tecido podem ser impedidos em produzir dados seguros e exactos do metabolismo mitocondrial devido ao rompimento causado pela presença de outros metabolitos cytosolic.
O papel das mitocôndria na doença
A actividade das mitocôndria foi ligada com diversas doenças, conseqüentemente, o estudo delas é significativo em crescer uma compreensão da revelação e da progressão da doença, e mesmo à revelação de tratamentos novos.
As mutações mitocondriais do ADN (mtDNA) têm sido ligadas já com os mitochondriopathies neuromusculares e neurodegenerative, o diabetes, as doenças cardiovasculares, as desordens gastrintestinais, as desordens da pele, o envelhecimento, e o cancro.
Por exemplo, um número crescente de estudos está explorando o papel das mitocôndria no cancro. As mutações no mtDNA foram relatadas no adenocarcinoma renal, as pilhas de cancro do cólon, os tumores da cabeça e do pescoço, tumores astrocytic, tumores do tiróide, tumores do peito, tumores ovarianos, cancro da próstata e de bexiga, neuroblastomas e oncocytomas.
As mutações em ADN nuclear (nDNA) foram encontradas para afectar indirectamente o mtDNA, e igualmente ligadas com os cancros específicos.
Também, a actividade mitocondrial é sabida para ser essencial a manter a função apropriada dos tecidos e dos órgãos que confiam em níveis altos e consistentes de energia, tais como o coração. Os distúrbios às mitocôndria conseqüentemente foram ligados com a doença cardiovascular (CVD), e o uso da fracção mitocondrial está sendo usado nos estudos para investigar esta relação e para explicar o papel completo das mitocôndria no CVD.
E também a implicação em várias doenças, há um grupo específico de desordens herdadas que são classificadas com a falha das mitocôndria produzir bastante energia para permitir que o corpo funcione correctamente.
Estes são referidos como doenças mitocondriais. Podem afectar qualquer parte do corpo, dos neurónios e dos nervos aos músculos, ao coração, ao fígado, aos rins, ao pâncreas e mesmo aos olhos e às orelhas. Quando estas doenças forem raras, ao redor 1.000 a 4.000 crianças são nascidas nos E.U. todos os anos com a doença, que podem ser fatal, e para qual lá não é nenhuma cura conhecida.
Conseqüentemente, o uso do fraccionamento mitocondrial estudar o comportamento das mitocôndria nestas doenças é essencial à investigação continuada das terapias potenciais novas que poderiam melhorar a qualidade de vida e impedir fatalidades.
Sumário
O fraccionamento mitocondrial é um método vital para separar culturas das mitocôndria das amostras da pilha a fim estudá-las. Esta técnica provou inestimável a crescer uma compreensão da função das mitocôndria e do seu papel em um número de doenças, assim como à ajuda desenvolver terapias novas potenciais para a doença.
Fontes
- Chistiakov, D., Shkurat, T., Melnichenko, A., Grechko, A. e Orekhov, A. (2017). O papel da deficiência orgânica mitocondrial na doença cardiovascular: uma breve revisão. Anais da medicina, 50(2), pp.121-127. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29237304
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