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Quelle est cytométrie de flux en couleurs ?

Les scientifiques emploient la cytométrie de flux en couleurs pour recenser et caractériser les sous-populations cellulaires visées à l'aide des bornes fluorescentes multiples. La technologie a vu les avancements rapides mener ces dernières années aux améliorations de la méthode, ayant pour résultat une technique robuste et fiable pour exécuter l'analyse cellulaire complexe rapidement et efficacement en évaluant plusieurs paramètres simultanément.

cytométrie de flux en couleursCrédit d'image : Kateryna Kon/Shutterstock.com

En quelques juste secondes, l'analyse peut vérifier des milliers de cellules. En outre, le répertoire hautement des anticorps spécifiques utilisés pour recenser des substances augmente soutenu. Suite à ceci, des instruments plus avancés de cytométrie de flux ont été développés, tenant compte de l'analyse simultanée de plus de 20 paramètres. Comme résultat, la cytométrie de flux en couleurs a été instrumentale en avançant le progrès de la recherche en sciences de la vie.

Les éléments de la cytométrie de flux

La cytométrie de flux est la composante de base de la cytométrie de flux en couleurs. Essentiellement, la procédure a été conçue pour analyser simultanément des milliers de cellules en travers des paramètres multiples, faisant ainsi dans juste une question des secondes.

Le procédé commence par mettre un échantillon préparé dans la chambre du flux de l'instrument de cytométrie, où il entre dans un système de fluidique. À ce stade, le procédé de s'orienter hydrodynamique est employé pour séparer l'échantillon dans ses composantes unicellulaires. Pendant ce procédé, un ordre d'exécution est introduit autour de l'échantillon, le forçant dans un diamètre étroit et obligeant les cellules à séparer.

Après ceci, les cellules séparées traversent un laser qui enregistre chaque cellule individuelle comme événement. Sur l'interaction avec le laser, la diffusion vers l'avant (FSC) et la diffusion latérale (SSC) sont produites par chaque cellule, qui est enregistrée par l'instrument. En ces cellules qui sont fluorescent marquées, le fluorophore devient enthousiaste pendant qu'il traverse le laser et émet cette lumière pendant qu'elle revient à son prise de masse-état.

Cette lumière émise est mesurée pendant qu'elle traverse une suite de miroirs et de filtres jusqu'à ce qu'elle atteigne le détecteur approprié pour la longueur d'onde visée. Ces détecteurs, connus sous le nom de tubes photomultiplicateurs (PMTs), identifient la fluorescence d'une certaine, prédéterminée longueur d'onde.

Afin de permettre seulement aux longueurs d'onde légères exigées de réussir, un filtre optique (filtre dichroïque) est utilisé pour bloquer à l'extérieur des longueurs d'onde non désirées et pour agir en tant que miroir, qui guide les longueurs d'onde spécifiques de la lumière aux détecteurs.

Dépistage en cytométrie de flux

La cytométrie de flux se fonde sur une combinaison des fluorophores et des anticorps comme réactifs de dépistage. Fluorophores peut absorber et émettre des longueurs d'onde spécifiques de la lumière d'une large gamme, selon le fluorophore. Ceci est connu comme spectres d'absorbance et d'émission.

Pendant la cytométrie de flux, une longueur d'onde spécifique de la lumière est absorbée par le fluorophore. Cette énergie de la lumière est transférée aux électrons fluorophore, entraînant l'excitation. Comme renvois fluorophore à son prise de masse-état, elle relâche l'énergie sous forme de photon d'une plus longue longueur d'onde que cela qui au commencement excitation induite.

L'élément en couleurs de la cytométrie de flux se fonde sur les Commissions en couleurs qui exigent l'utilisation des teintures tandem. Des teintures tandem se composent d'un fluorophore de distributeur qui produit des caractéristiques d'excitation, et d'un accepteur différent fluorophore qui produit les caractéristiques d'émission.

Elle est habituelle pour les éventails d'émission des fluorophores pour superposer, qui peuvent entraîner des éditions en affichant les caractéristiques parce que la superposition peut produire d'un signe faussement positif. Dans des expériences en couleurs, cette superposition spectrale peut être un problème particulier, qui les moyens il doivent être réglés pour par la compensation. La compensation élimine les possibilités des faux positifs de la superposition en veillant que la fluorescence trouvée commencée du fluorophore mesuré.

Méthodes de détection de l'antigène

Il y a deux méthodes de détection de l'antigène en cytométrie de flux. Le premier est la méthode directe, où l'anticorps primaire est directement conjugué à un fluorophore. Le deuxième est la méthode indirecte, où l'anticorps primaire est non-conjugué et un anticorps secondaire fluorophore-conjugué dirigé contre l'anticorps primaire est employé pour le dépistage.

Il y a des avantages et des inconvénients de chaque méthode ; cependant, la méthode directe est la plus utilisée généralement dans des expériences en couleurs dues à sa facilité comparative de production.

Installation en couleurs d'expérience

Établissant la Commission est considéré la partie la plus difficile de l'installation en couleurs d'expérience. D'abord, les antigènes qui sont d'intérêt sont sélectés. Alors les lasers qui ont la longueur d'onde correspondante aux fluorophores sont sélectés.

Ensuite, la population cellulaire est considérée. Dans les cas où l'expression d'antigène est inconnue et/ou la population cellulaire inférieure est prévue, un fluorophore plus lumineux est employé. Là où une population cellulaire élevée d'expression et/ou de haut d'antigène est prévue, un fluorophore plus obscur est employé.

Après ceci, des mesures doivent être prises pour réduire à un minimum la superposition spectrale en sacrifiant les fluorochromes lumineux pour éviter la superposition et à l'aide de la compensation pour régler pour ceci.

En outre, des contrôles devraient être compris dans l'installation. Des cellules non souillées peuvent être employées pour déterminer les populations négatives, la taille de cellules, et la granularité. Sous tension/complètement les bornes sont utiles en isolant des cellules saines. des contrôles positifs Unique-souillés sont employés pour régler la compensation, et en considérant l'intensité de la fluorescence sans on souillant, des populations positives peuvent être recensées.

En conclusion, la concentration en anticorps devrait être optimisée en fatiguant les anticorps. Ceci aide à éviter le grippement non spécifique ou la sensibilité réduite.

La cytométrie de flux générale et en couleurs s'est développée en méthode robuste et fiable pour analyser les sous-populations dans une cellule. Pendant que des avancements en technologie ont été effectués, la méthode s'est améliorée, et les chercheurs tirent bénéfice des temps rapides de contrôle et de la capacité d'analyser simultanément plus de 20 paramètres à la fois.

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Last Updated: Dec 12, 2019

Sarah Moore

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Sarah Moore

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