Che cosa è citometria a flusso multicolore?

Gli scienziati usano la citometria a flusso multicolore per identificare e caratterizzare le sottopopolazioni cellulari mirate a per usando gli indicatori fluorescenti multipli. La tecnologia ha veduto gli avanzamenti rapidi negli ultimi anni piombo ai miglioramenti nel metodo, con conseguente tecnica robusta ed affidabile per l'esecuzione dell'analisi cellulare complessa rapido ed efficientemente valutando parecchi parametri simultaneamente.

citometria a flusso multicoloreCredito di immagine: Kateryna Kon/Shutterstock.com

Appena nei secondi, l'analisi può studiare migliaia di celle. Inoltre, il repertorio degli anticorpi altamente specifici usati per l'identificazione delle sostanze sta espandendosi continuamente. Più ulteriormente a questo, gli strumenti più avanzati di citometria a flusso sono stati sviluppati, tenendo conto l'analisi simultanea oltre di 20 parametri. Di conseguenza, la citometria a flusso multicolore è stata strumentale nell'avanzamento del progresso della ricerca nelle scienze biologiche.

Le basi di citometria a flusso

La citometria a flusso è la componente di base di citometria a flusso multicolore. In pratica, la procedura è stata destinata per analizzare simultaneamente migliaia di celle attraverso i parametri multipli, agenti in tal modo appena in un aspetto dei secondi.

Il trattamento comincia con il collocamento del campione pronto nella camera del flusso dello strumento di cytometry, in cui entra in un sistema di fluidics. In questa fase, il trattamento di messa a fuoco idrodinamica è usato per separare il campione nelle sue componenti unicellulari. Durante questo trattamento, un flusso controllato è introdotto intorno al campione, forzante lo in un diametro stretto e costringente le celle a separare.

A seguito di questo, le celle separate attraversano un laser che registra ogni cella determinata come evento. Su interazione con il laser, lo spargimento di andata (FSC) e lo spargimento laterale (SSC) sono prodotti da ogni cella, che è registrata dallo strumento. In quelle celle che fluorescente sono contrassegnate, il fluorophore è emozionante mentre attraversa il laser ed emette questo indicatore luminoso mentre ritorna al suo stato fondamentale.

Questo indicatore luminoso emesso è misurato mentre attraversa una serie di specchi e di filtri finché non raggiunga il rivelatore appropriato per la lunghezza d'onda mirata a. Questi rivelatori, conosciuti come i tubi di fotomoltiplicatore (PMTs), riconoscono la fluorescenza di determinata, lunghezza d'onda predeterminata.

Per permettere che soltanto le lunghezze d'onda leggere richieste passino da parte a parte, un filtro ottico (filtro dicroico) è utilizzato per bloccare fuori le lunghezze d'onda indesiderate e per fungere da specchio, che guida le lunghezze d'onda specifiche di indicatore luminoso ai rivelatori.

Rilevazione in citometria a flusso

La citometria a flusso conta su una combinazione di fluorophores e di anticorpi come reagenti di rilevazione. Fluorophores può assorbire ed emettere le lunghezze d'onda specifiche di indicatore luminoso da una vasta gamma, secondo il fluorophore. Ciò è conosciuta come gli spettri di emissione e di capacità di assorbimento.

Durante la citometria a flusso, una lunghezza d'onda specifica di indicatore luminoso è assorbita dal fluorophore. Questa energia leggera è trasferita agli elettroni fluorophore, causanti l'eccitazione. Come i rendimenti fluorophore al suo stato fondamentale, rilascia l'energia sotto forma di fotone di una lunghezza d'onda più lunga che quello che inizialmente ha indotto l'eccitazione.

L'elemento multicolore di citometria a flusso conta sui comitati multicolori che richiedono l'uso delle tinture in tandem. Le tinture in tandem si compongono di un fluorophore erogatore che genera le caratteristiche di eccitazione e di un altro ricettore fluorophore che crea le caratteristiche dell'emissione.

È solito per le gamme di emissione di fluorophores sovrapporrsi, che possono causare le emissioni nella lettura dei dati perché la sovrapposizione può generare un segnale erroneamente positivo. All'interno degli esperimenti multicolori, questa sovrapposizione spettrale può essere un problema particolare, che i mezzi devono essere controllati per da compensazione. La compensazione elimina le probabilità dei falsi positivi dalla sovrapposizione assicurandosi che la fluorescenza individuata iniziata dal fluorophore misurato.

Metodi di rilevazione dell'antigene

Ci sono due metodi di rilevazione dell'antigene in citometria a flusso. Il primo è il metodo diretto, dove l'anticorpo primario direttamente è coniugato ad un fluorophore. Il secondo è il metodo indiretto, dove l'anticorpo primario è unconjugated e un anticorpo secondario fluorophore-coniugato diretto contro l'anticorpo primario è usato per rilevazione.

Ci sono vantaggi e svantaggi di ogni metodo; tuttavia, il metodo diretto è più comunemente usato negli esperimenti multicolori dovuto la sua facilità comparativa di produzione.

Impostazione multicolore di esperimento

Costruendo il comitato è considerato come la parte più difficile dell'impostazione multicolore di esperimento. In primo luogo, gli antigeni che sono di interesse sono selezionati. Poi i laser che hanno la lunghezza d'onda corrispondente ai fluorophores sono selezionati.

Dopo, la popolazione delle cellule è considerata. Nei casi in cui l'espressione dell'antigene è sconosciuta e/o la popolazione bassa delle cellule è preveduta, un fluorophore più luminoso è usato. Dove un'alta espressione dell'antigene e/o un'alta popolazione delle cellule è preveduta, un fluorophore più tenue è usato.

Dopo questo, le misure devono essere catturate per minimizzare la sovrapposizione spettrale sacrificando i fluorocromi luminosi per evitare la sovrapposizione ed usando la compensazione per gestire per questa.

Inoltre, i comandi dovrebbero essere inclusi nell'impostazione. Le celle non macchiate possono essere usate per la determinazione le popolazioni negative, la dimensione delle cellule e della granularità. In tensione/completamente gli indicatori sono utili nell'isolazione delle celle in buona salute. i comandi positivi Unico macchiati sono usati per la collocazione della compensazione e considerando l'intensità della fluorescenza meno una che macchia, le popolazioni positive possono essere identificate.

Per concludere, la concentrazione nell'anticorpo dovrebbe essere ottimizzata stancando gli anticorpi. Ciò contribuisce ad evitare l'associazione non specifica o la sensibilità diminuita.

La citometria a flusso globale e multicolore si è sviluppata in un metodo attendibile robusto e per analizzare le sottopopolazioni all'interno di una cella. Mentre gli avanzamenti nella tecnologia sono stati fatti, il metodo è migliorato ed i ricercatori stanno traendo giovamento dai tempi veloci di prova e dalla capacità di analizzare simultaneamente oltre 20 parametri per volta.

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Last Updated: Dec 12, 2019

Sarah Moore

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Sarah Moore

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