¿Cuál es Cytometry de flujo multicolor?

Los científicos utilizan cytometry de flujo multicolor para determinar y para caracterizar a subpoblaciones celulares apuntadas usando marcadores fluorescentes múltiples. La tecnología ha considerado adelantos rápidos estos últimos años el llevar a las mejorías en el método, dando por resultado una técnica robusta y segura para realizar análisis celular complejo rápidamente y eficientemente evaluando varios parámetros simultáneamente.

cytometry de flujo multicolorHaber de imagen: Kateryna Kon/Shutterstock.com

En apenas segundos, el análisis puede investigar millares de células. También, el repertorio de los anticuerpos altamente específicos usados para determinar substancias se está desplegando continuamente. Siguiendo esto, se han desarrollado instrumentos más avanzados del cytometry de flujo, teniendo en cuenta el análisis simultáneo sobre de 20 parámetros. Como consecuencia, el cytometry de flujo multicolor ha sido instrumental en el avance del progreso de la investigación en las ciencias de la vida.

Los fundamentos del cytometry de flujo

El cytometry de flujo es el componente básico del cytometry de flujo multicolor. Esencialmente, el procedimiento se ha diseñado para analizar simultáneamente los millares de células a través de parámetros múltiples, haciendo tan en apenas una cuestión de segundos.

El proceso comienza con la colocación de una muestra preparada en la cámara del flujo del instrumento del cytometry, donde incorpora un sistema de la fluídica. En esta etapa, el proceso del enfoque hidrodinámico se utiliza para separar la muestra en sus componentes unicelulares. Durante este proceso, un flujo de control se introduce alrededor de la muestra, forzándolo en un diámetro estrecho y obligando a las células que se separen.

Después de esto, las células separadas pasan a través de un laser que registre cada célula individual como acción. En la acción recíproca con el laser, la dispersión frontal (FSC) y la dispersión lateral (SSC) son producidas por cada célula, que es registrada por el instrumento. En esas células que fluorescente etiqueta, el fluoróforo llega a ser emocionado como pasa a través del laser y emite esta luz mientras que vuelve a su tierra-estado.

Se mide esta luz emitida mientras que pasa con una serie de espejos y de filtros hasta que alcance el detector apropiado para la longitud de onda apuntada. Estos detectores, conocidos como tubos de fotomultiplicador (PMTs), reconocen la fluorescencia de longitud de onda cierta, predeterminada.

Para permitir que solamente las longitudes de onda livianas requeridas pasen a través, un filtro óptico (filtro dicroico) se utiliza para bloquear longitudes de onda indeseadas y para actuar como espejo, que conduce las longitudes de onda específicas de la luz a los detectores.

Detección en cytometry de flujo

El cytometry de flujo confía en una combinación de fluorophores y de anticuerpos como reactivos de la detección. Fluorophores puede absorber y emitir longitudes de onda específicas de la luz de una amplia gama, dependiendo del fluoróforo. Esto se conoce como los espectros de la absorción y de emisión.

Durante cytometry de flujo, una longitud de onda específica de la luz es absorbida por el fluoróforo. Esta energía liviana se transfiere a los electrones fluoróforos, causando la excitación. Como los retronos fluoróforos a su tierra-estado, libera la energía bajo la forma de fotón de una longitud de onda más larga que el que indujo inicialmente la excitación.

El elemento multicolor del cytometry de flujo confía en los paneles multicolores que requieren el uso de tintes en tándem. Los tintes en tándem se componen de un fluoróforo dispensador de aceite que genere características de la excitación, y de otro aceptor fluoróforo que cree las características de la emisión.

Es usual para los espectros de emisión de los fluorophores recubrir, que pueden causar entregas en la lectura de los datos porque el recubrimiento puede generar una señal falso-positiva. Dentro de experimentos multicolores, este recubrimiento espectral puede ser un problema determinado, que los medios él deben ser controlados para por la remuneración. La remuneración elimina las ocasiones de positivos falsos de recubrimiento asegurándose de que la fluorescencia descubierta iniciada del fluoróforo medida.

Métodos de detección del antígeno

Hay dos métodos de detección del antígeno en cytometry de flujo. El primer es el método directo, donde el anticuerpo primario se conjuga directamente a un fluoróforo. El segundo es el método indirecto, donde está sin conjugar el anticuerpo primario y un anticuerpo secundario fluoróforo-conjugado dirigido contra el anticuerpo primario se utiliza para la detección.

Hay ventajas y desventajas de cada método; sin embargo, el método directo es el más de uso general de los experimentos multicolores debido a su facilidad comparativa de la producción.

Montaje multicolor del experimento

Construyendo el panel se considera para ser la parte más difícil del montaje multicolor del experimento. Primero, se seleccionan los antígenos que están de interés. Entonces los laseres que tienen la longitud de onda correspondiente a los fluorophores se seleccionan.

Después, se considera la población de la célula. En caso de que la expresión del antígeno sea desconocida y/o se prevee la población inferior de la célula, se utiliza un fluoróforo más brillante. Donde se prevee una alta expresión del antígeno y/o una alta población de la célula, se utiliza un fluoróforo más oscuro.

Después de esto, las medidas se deben tomar para disminuir recubrimiento espectral sacrificando los fluorocromos brillantes para evitar recubrimiento y usando la remuneración para controlar para esto.

También, los mandos se deben incluir en el montaje. Las células sin manchas se pueden utilizar para determinar las poblaciones negativas, talla de célula, y granulosidad. Vivo/absolutamente los marcadores son útiles en el aislamiento de las células sanas. los mandos positivos Único-manchados se utilizan para fijar la remuneración, y considerando la intensidad de la fluorescencia menos una que mancha, las poblaciones positivas pueden ser determinadas.

Finalmente, la concentración del anticuerpo debe ser optimizada cansando los anticuerpos. Esto ayuda a evitar el atascamiento no específico o la sensibilidad reducida.

El cytometry de flujo total, multicolor se ha convertido en un método robusto y de confianza para analizar a las subpoblaciones dentro de una célula. Mientras que los adelantos en tecnología se han hecho, el método ha perfeccionado, y los investigadores se están beneficiando de tiempos rápidos de la prueba y de la capacidad para analizar simultáneamente sobre 20 parámetros al mismo tiempo.

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Last Updated: Dec 12, 2019

Sarah Moore

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