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Quelle est électrophorèse en gel de polyacrylamide (PAGE) ?

Les techniques électrophorétiques séparent les molécules chargées dans un champ électrique. La mobilité d'une molécule est inversement proportionnelle à sa taille et directement proportionnel à sa charge. Pendant l'électrophorèse, les protéines déménagent vers une électrode à l'opposé chargée dans un champ électrique.

Le régime de leur mouvement dans un système électrophorétique est régi par plusieurs facteurs tels que la température, le pH, et la concentration de tampon en plus des propriétés intrinsèques telles que la taille, la charge et la forme des protéines.

La séparation électrophorétique des protéines strictement sur la base de leur poids moléculaire est possible seulement si la charge de toutes les molécules de protéine peut être manipulée au même signe. En pareil cas, la mobilité des molécules de protéine sera seulement dépendante sur leur taille.

L'électrophorèse en gel de polyacrylamide (PAGE) est une technique basée sur cette idée et est employée pour séparer des protéines sur la base de leur taille.

Principes de PAGE

En PAGE, un sulfate dodécylique de sodium appelé de détergent anionique (SDS) est employé pour gripper aux protéines et pour leur donner une charge négative. Des protéines sont alors séparées électrophorétiquement selon leur taille utilisant une modification de gel faite de polyacrylamide dans un champ électrique.

Le polyacrylamide est produit en raison de la réaction de polymérisation entre l'acrylamide et le N, le N'-méthylène-BRI-acrylamide (BRI) utilisant un catalyseur. Le degré de polymérisation ou d'édition absolue peut être réglé en réglant la concentration de l'acrylamide et de la BRI.

Plus l'édition absolue plus le gel est dur. La dureté du gel, consécutivement, module la friction remarquée par des macromolécules quand ils se déplacent par le gel pendant la PAGE, de ce fait affectant la définition de la séparation.

Les gels desserrés (acrylamide 4-8%) permettent à des molécules plus élevées de poids moléculaire d'émigrer plus rapidement par le gel tandis que les gels durs (acrylamide 12-20%) limitent le transfert de grandes molécules et sélecteur permettent les petits de déménager par le gel.

gels de charge d

Protocole de SDS-PAGE

1. Préparation des échantillons :

Des échantillons de protéine sont dénaturés en les chauffant avec un détergent SDS et le mercaptoéthanol. L'ancien grippe fortement aux protéines et leur donne une charge négative élevée tandis que ce dernier libère les groupes sulfhydryliques, de ce fait fournir le polypeptide enchaîne transporter une charge négative excédentaire et la charge assimilée au rapport de masse. Ceci aide la définition des protéines strictement basées sur leur taille pendant l'électrophorèse en gel.

2. Préparation de gel :

Le gel électrophorétique a habituellement plusieurs composantes comprenant l'acrylamide, la BRI, et un tampon. Le mélange est dégazé pour éviter la formation de bulle pendant la polymérisation du gel. Le persulfate d'ammonium, une source de radical libre, et un stabilisateur sont ajoutés à la polymérisation de début. La BRI est également ajoutée aux réticulations de forme entre les molécules d'acrylamide jusqu'à ce qu'un gel soit éventuel formé.

3. Électrophorèse :

Pendant qu'un courant électrique est appliqué les protéines émigrent par le gel à l'électrode positive car elles ont une charge négative. Chaque molécule déménage à un régime différent basé sur son poids moléculaire - mouvement de petites molécules plus rapidement par le gel que le plus grand. Le transfert est habituellement plus rapide à des tensions plus élevées. Après quelques heures, toutes les molécules de protéine sont séparées par taille.

4. Souillure et visualisation :

Une fois que l'électrophorèse est complète, le gel peut être souillé utilisant les teintures colorées telles que le bleu de Coomassie ou le bromure d'éthidium brillant pour effectuer les protéines séparées apparaître en tant que bandes colorées distinctes sur le gel.

La teinture non liée est effacée du gel. Les gels souillés sont alors séchés ainsi l'intensité de couleur des bandes de protéine peut être mesurée. Des bandes des protéines radioactives peuvent être trouvées par l'autoradiographie. Les protéines peuvent également être mesurées comme teneur en protéines est directement proportionnelle à la quantité de la teinture attachée.

Quelques systèmes de gel introduisent une teinture de rail telle que le bleu de bromophénol avec l'échantillon de protéine - la distance visible s'est déplacée par la teinture sur les aides de gel en décidant la durée exigée de l'électrophorèse. Le bleu de bromophénol se déplace avec les molécules témoin jusqu'à ce qu'il atteigne éventuellement le bas du gel. L'électrophorèse doit cesser en ce point de n'assurer aucune molécule de protéine electrophorese hors du gel et dans le tampon.

Électrophorèse en gel

Références :

  1. http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/sdspage/sdspage.html#PAGE
  2. http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf
  3. https://www.thermofisher.com/ca/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/overview-electrophoresis.html
  4. https://www.udel.edu/biology/fschmieg/411acrylamide.htm

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Last Updated: Jun 28, 2019

Susha Cheriyedath

Written by

Susha Cheriyedath

Susha has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Chemistry and Master of Science (M.Sc) degree in Biochemistry from the University of Calicut, India. She always had a keen interest in medical and health science. As part of her masters degree, she specialized in Biochemistry, with an emphasis on Microbiology, Physiology, Biotechnology, and Nutrition. In her spare time, she loves to cook up a storm in the kitchen with her super-messy baking experiments.

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